蛋氨酸羥基類似物在保育豬飼料中應(yīng)用的安全性評(píng)估及其對(duì)肝臟蛋氨酸和膽固醇代謝的影響.pdf

1、蛋氨酸羥基類似物的化學(xué)名為2-羥基-4-甲硫基丁酸（2-hydroxy-4-methylthiobutanoic acid，HMB），具有與蛋氨酸相同的生物學(xué)活性。由于其合成工藝簡(jiǎn)單，成本較低，可作為蛋氨酸的替代品應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，HMB能促進(jìn)肉雞和豬生長(zhǎng)，提高飼料轉(zhuǎn)化率，而北京鴨飼喂過量的HMB可導(dǎo)致日增重下降，安全性評(píng)估研究確定HMB在鴨飼料中添加的最大限量為2.26％。然而，HMB在生長(zhǎng)豬日糧中添加的安全劑量尚未確定。鑒此

2、，農(nóng)業(yè)部立項(xiàng)并委托本實(shí)驗(yàn)室對(duì)HMB在保育豬飼料中應(yīng)用的安全性進(jìn)行評(píng)估，并確定其最大添加限量。
　　因此，本研究以30～35日齡的斷奶仔豬為研究對(duì)象，研究不同添加水平的HMB對(duì)保育豬生產(chǎn)性能、血液生理生化指標(biāo)，以及重要器官組織形態(tài)的影響，探索過量添加HMB對(duì)保育豬肝臟蛋氨酸和膽固醇代謝的影響及其機(jī)制，為HMB在仔豬飼料中的合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　1 HMB在保育豬飼料中應(yīng)用的安全性評(píng)估
　　選取144頭雄性杜長(zhǎng)大斷奶

3、仔豬，隨機(jī)分成四組（每組三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12頭豬），分別添加0.11％、0.55％、1.10％和1.65％的HMB，每天記錄采食量，飼喂28天。采樣前禁食過夜，從每個(gè)重復(fù)中選取2頭豬屠宰采樣，記錄各臟器重量，計(jì)算臟器指數(shù)。分離血漿置-20℃冰箱保存，肝臟樣品于液氮中速凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，采集心臟、肝臟、脾臟、腎臟、十二指腸和背最長(zhǎng)肌組織樣品，并制作組織學(xué)切片和HE染色。
　　結(jié)果表明，與對(duì)照組（推薦用量0.11％）相比較，

4、日糧中添加1.65％的HMB顯著降低了仔豬采食量(P＜0.05)和體重(P＜0.05)，而對(duì)飼料轉(zhuǎn)化率沒有顯著影響。日糧中添加1.10％和1.65％的HMB顯著降低了保育豬心臟的重量(P＜0.05)。日糧中添加1.65％的HMB顯著提高了血液中同型半胱氨酸的濃度(P＜0.05)，而對(duì)其他生化指標(biāo)沒有顯著影響。此外，與對(duì)照組相比較，日糧中添加1.10％的HMB顯著升高了血漿天冬氨酸(P＜0.05)和谷氨酸的含量(P＜0.05);添加1.6

5、5％的HMB顯著提高了蛋氨酸和賴氨酸的水平(P＜0.05);添加0.55％、1.10％和1.65％的HMB顯著降低了血液中甘氨酸水平，以及顯著提高血液中半胱氨酸的水平(P＜0.05)。
　　心臟、肝臟、脾臟、腎臟、十二指腸和背最長(zhǎng)肌組織切片HE染色結(jié)果表明，與對(duì)照組相比較，日糧中添加1.10％和1.65％的HMB組仔豬肝臟組織中發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞聚集，而對(duì)其他臟器組織形態(tài)沒有明顯影響。
　　以上結(jié)果表明，日糧中高水平（1.10％或1

6、.65％）的HMB能夠抑制保育仔豬的生產(chǎn)性能，同時(shí)影響仔豬血液生化指標(biāo)以及肝臟組織形態(tài)。由此，我們給出的結(jié)論是仔豬日糧中添加HMB的最大安全劑量為0.55％。
　　2日糧中添加高水平HMB對(duì)保育仔豬肝臟蛋氨酸代謝的影響
　　基于第一章的結(jié)果，我們選取高水平組(1.65％)和對(duì)照組(0.11％)深入研究日糧中添加高水平的HMB對(duì)仔豬肝臟蛋氨酸代謝的影響。
　　使用超高效液相色譜儀(UPLC)檢測(cè)血清和肝臟的同型半胱氨酸(

7、Hcy)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，結(jié)果顯示:日糧中添加1.65％的HMB顯著提高仔豬血清和肝臟中的Hcy(P＜0.05)和SAH含量(P＜0.01)。同時(shí)，SAM∶SAH的比值與對(duì)照組相比極顯著降低(P＜0.01)。為檢測(cè)肝臟全基因組DNA甲基化程度的變化，我們分別采用狹縫印跡法(Slot blotting)和蛋白免疫印跡法檢測(cè)肝臟全基因組DNA甲基化水平以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3a和DNMT3b

8、的表達(dá)，但均未發(fā)現(xiàn)顯著變化。
　　此外，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡方法檢測(cè)仔豬肝臟中蛋氨酸代謝關(guān)鍵基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示:日糧中添加1.65％的HMB顯著增加了仔豬肝臟甘氨酸-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(GNMT) mRNA(P＜0.05)和蛋白表達(dá)(P＜0.01)。同時(shí)，甲基化DNA免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，GNMT外顯子1甲基化水平顯著降低(P＜0.05)，與其mRNA的上調(diào)相吻合。
　　以上結(jié)果表明，日糧中添加1.65

9、％的HMB可干擾保育豬肝臟蛋氨酸代謝，但對(duì)肝臟全基因組DNA甲基化水平無顯著影響。
　　3日糧中添加高水平HM對(duì)保育豬肝臟膽固醇代謝的影響
　　日糧中添加1.65％的HMB顯著增加仔豬肝臟中總膽固醇(P＜0.05)和游離膽固醇(P＜0.05)含量。盡管肝臟膽固醇代謝相關(guān)基因在mRNA水平未發(fā)生顯著變化，膽固醇合成關(guān)鍵基因HMGCR的蛋白含量顯著增加(P＜0.05)，而膽固醇酯化蛋白ACAT1的蛋白含量顯著降低(P＜0.01)

10、，提示可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。由此，我們預(yù)測(cè)了靶向HMGCR和ACAT13'UTR的miRNAs，并進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，1.65％的HMB顯著降低了靶向HMGCR的miR-150和miR-296-3p的表達(dá)，而顯著提高了miR-222的表達(dá)(P＜0.05)。但是，靶向ACAT13'UTR的miR-2320-5p無顯著差異。由此可見，日糧中添加1.65％的HMB導(dǎo)致仔豬肝臟膽固醇含量增加，可能與肝臟膽固醇合成增強(qiáng)，而膽固醇向肝外運(yùn)輸降低有