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文檔簡介
1、樹突狀細(xì)胞(DC)作為功能最強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞(APC),最大的特點(diǎn)是能夠刺激初始(naive)T細(xì)胞增殖和啟動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng),在誘導(dǎo)特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫中起關(guān)鍵作用。由于DC具有強(qiáng)烈的免疫激活作用,它的抗腫瘤功能成為近年來備受矚目的熱點(diǎn)。前期實(shí)驗(yàn)研究表明,以適當(dāng)形式的腫瘤抗原加載的DC疫苗都能夠激活抗原特異性T細(xì)胞識(shí)別、殺傷腫瘤細(xì)胞,從而產(chǎn)生特異性的抗腫瘤反應(yīng)。但是進(jìn)行DC的體外擴(kuò)增及誘導(dǎo)成熟,操作復(fù)雜,重復(fù)性差,大大限制了它的應(yīng)用。
2、 將特異性腫瘤抗原與單克隆抗體制備為融合蛋白,人為干預(yù)體內(nèi)DC功能調(diào)節(jié),以增強(qiáng)其T細(xì)胞活化功能是增強(qiáng)DC誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的新方式,它利用單抗與DC的特異性結(jié)合而將腫瘤抗原定向給予(targeting delivery)到DC,使其被內(nèi)吞,經(jīng)加工處理后提呈于細(xì)胞表面,激活T細(xì)胞。但前期研究結(jié)果顯示,這種融合蛋白非但沒能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng),反而在正常免疫力小鼠中誘導(dǎo)出免疫耐受,推測可能原因是非成熟DC(iDC)不能被激活形成成熟
3、DC(mDC),因而在外周誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞的清除和無能(anergy)。 本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)構(gòu)建了新型DC靶向腫瘤疫苗FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188。FL是一種能夠刺激早期造血的細(xì)胞因子,不僅能使骨髓增加生產(chǎn)DC的數(shù)量,而且可使DC的功能趨向成熟,使后者具有更強(qiáng)的抗原遞呈和抗腫瘤作用。因此,可將FL作為刺激信號(hào)聯(lián)合CD11c抗體(αCD11c)將黑色素瘤相關(guān)抗原肽TRP2180-188定向給予DC
4、。CD11c作為小鼠DC表面特異性標(biāo)志,抗CD11c抗體具有特異靶向DC的作用,是體內(nèi)DC修飾的理想載體。 本研究主要探討該融合蛋白的免疫作用途徑及其對同系小鼠的抗腫瘤作用,包括以下幾個(gè)方面: 一、融合基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 利用基因工程技術(shù),構(gòu)建FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188融合蛋白的表達(dá)載體。首先用5'RACE技術(shù)獲得倉鼠抗小鼠CD11c抗體(N418)輕、重鏈可變區(qū)序列,VH和VL經(jīng)o
5、verlap PCR的方法獲得單鏈抗體,并在3'末端通過(Gly4Ser)3連接TRP2180-188。FL-Fc融合基因已由本所構(gòu)建,經(jīng)overlap PCR通過(Gly4Ser)3在3'末端連接αCD11c-TRP2180-188,得到大小為2190bp的FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188的融合基因。將融合基因通過兩端的酶切位點(diǎn)裝入線性化的表達(dá)載體pcDNA3.1(+),經(jīng)酶切測序鑒定,成功構(gòu)建融合基因的真核表達(dá)載體。
6、 二、融合蛋白的表達(dá)、純化與體外靶向功能檢測 通過脂質(zhì)體法將FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188/pcDNA3.1(+)融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,72h后在上清中可檢測到目的蛋白。通過篩選劑、Dot-Blot篩選出高表達(dá)克隆,經(jīng)擴(kuò)增及適應(yīng)性無血清培養(yǎng)后,收集培養(yǎng)上清,Protein A親和層析柱純化得到FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188融合蛋白,SDS-PAGE和Westem-Blot顯示融合蛋白
7、為三聚體,單體大小80KDa。在體外擴(kuò)增培養(yǎng)小鼠骨髓DC,在收獲的細(xì)胞中,CD11c+細(xì)胞占90%,FACS結(jié)果顯示融合蛋白能特異性結(jié)合DC細(xì)胞。 三、融合蛋白的免疫增強(qiáng)作用 用FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188融合蛋白致敏C57BL/6小鼠,在免疫后8h分離出淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞,其中CD11c+FL+、CD11c+CD86+細(xì)胞數(shù)量明顯高于無關(guān)抗體對照組,表明FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188
8、融合蛋白在體內(nèi)可通過CD11c抗體靶向連接于DC,并可誘導(dǎo)DC的體外成熟。在免疫后7d分離出的淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)負(fù)載抗原的DC刺激后可發(fā)生特異性T細(xì)胞的增殖,同時(shí)分泌IFNγ、TNFα等Th1型細(xì)胞因子,收獲的CTL對表達(dá)TRP2的小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16/F1有抗原特異性殺傷作用。結(jié)果表明FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188融合蛋白能夠特異性的增強(qiáng)機(jī)體免疫作用。 四、融合蛋白對同系小鼠的預(yù)防和治療作用 B1
9、6/F1是表達(dá)TRP2抗原的小鼠黑色素瘤細(xì)胞株,將1×104個(gè)B16/F1細(xì)胞背部皮下接種C57BL/6小鼠,隨機(jī)分3組,在接種后一周分別于皮下注射100μg FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188、FL-Fc與αCD11c-TRP2180-1881混合蛋白或等體積PBS,觀察50天,并測量腫瘤大小。結(jié)果顯示,FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188組腫瘤生長明顯受到抑制。各組小鼠經(jīng)間隔一周的兩次免疫后,接種1×104
10、個(gè)B16/F1,觀察50天,并測量腫瘤大小。結(jié)果顯示,FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188組成瘤率明顯降低,腫瘤大小比對照組小。將未長腫瘤的小鼠處死,分離單個(gè)核細(xì)胞,與B16/F1細(xì)胞作用,發(fā)現(xiàn)有對B16/F1腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用。 綜上所述,FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188融合蛋白能通過CD11c抗體與細(xì)胞表面CD11c特異性的結(jié)合而將腫瘤抗原肽TRP2定向給予到DC,FL則能夠促進(jìn)DC的成熟,
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