高產(chǎn)青霉素G?；肝⑸锞甑恼T變選育及產(chǎn)酶條件優(yōu)化.pdf

1、青霉素G?；?Penicillin G acylase，PGA，EC3.5.1.11)能水解青霉素，產(chǎn)生6-氨基青霉烷酸(6-APA);而6-APA是合成多種抗菌譜廣、抗菌作用強的半合成青霉素的重要原料。另外，此酶還可水解頭孢菌素，用于半合成頭孢菌素的重要中間體7-氨基脫乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)的生產(chǎn)。國內(nèi)外文獻表明，天然菌株的青霉素酰化酶酶活性普遍偏低，幾乎沒有工業(yè)應用價值。目前報道的各類菌株最高酶活力在40 U/mL，仍有

2、很大的提升空間。
　　本研究目的是選育高產(chǎn)青霉素G酰化酶的工業(yè)菌株。首先采用LiCl-紫外線復合誘變以及常壓室溫等離子體(ARTP)誘變技術(shù)對巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium) ATCC14945進行處理，獲得高產(chǎn)青霉素的菌株12-4，并對篩選得到的高產(chǎn)菌株12-4進行產(chǎn)酶條件優(yōu)化和酶分離純化的初步探究，為工業(yè)化生產(chǎn)青霉素?；柑峁└鼉?yōu)良的菌株及產(chǎn)酶條件。同時采用基因工程技術(shù)、微生物分離純化培養(yǎng)技術(shù)，以大腸桿菌

3、工程菌株、土壤等為材料，進行高產(chǎn)青霉素?；妇甑臉?gòu)建和篩選，為工業(yè)化生產(chǎn)青霉素?；柑峁└弋a(chǎn)菌株。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴采用LiCl-紫外線復合誘變以及ARTP誘變技術(shù)先后對巨大芽孢桿菌進行誘變，NIPAB法篩選高產(chǎn)的菌株。實驗得到高產(chǎn)菌株12-4，其酶活力由原菌株的4.65U/mL提高到39.60U/mL。對工程菌株12-4生物學特征初步探究發(fā)現(xiàn)，誘變后的菌株菌落表面略顯褶皺，β亞基表達增多，連續(xù)培養(yǎng)5代后菌株遺傳穩(wěn)定性

4、在60％以上。對菌株12-4表達和產(chǎn)酶條件的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，該菌株在液體培養(yǎng)6h后添加終濃度為0.2％的苯乙酸，繼續(xù)培養(yǎng)50 h后，PGA酶活力可達最大值:78.45 U/mL，比出發(fā)菌株提高了16.8倍。經(jīng)過初步分離純化，得率為64.48％。⑵采用微生物分離純化培養(yǎng)技術(shù)從土壤等原材料中篩選高產(chǎn)青霉素G酰化酶的天然微生物菌株。共得到菌株64株，其中13株菌株具有青霉素?；富钚?，活性都比較低，活性最高的為菌株K3，其活性為:0.398 U/m