產(chǎn)青霉素酶菌種的分離總結(jié)

1、產(chǎn)青霉素酶菌種的分離、純化及活性測定,,目錄,實驗原理實驗內(nèi)容實驗結(jié)果討論,實驗原理,青霉素酶又稱β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase,EC3.5.2.6),可水解β-內(nèi)酰胺類抗生素。利用青霉素酶具有水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的特點, 可將其用于抗菌藥物篩選?？莶菅挎邨U菌是常見的青霉素酶分泌菌種，革蘭氏陽性菌，屬芽孢桿菌。無莢膜，周生鞭毛，能運動；芽孢呈橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)

2、基中生長時，常形成皺醭。,實驗原理,紫外線作為物理誘變因子對誘變最有效的波長是在253-265 nm。紫外線誘變的主要生物學(xué)效應(yīng)是由于DNA 變化而造成的，DNA 對紫外線有強烈的吸收作用，尤其是堿基中的嘧啶，它比嘌呤更為敏感。在進行酶活力誘導(dǎo)時，采用剩余碘量法測定，以標(biāo)準(zhǔn)對照法計算含量。青霉素在堿性條件下水解，生成的青霉噻唑酸在酸性條件下與定量過量的碘作用，剩余的碘用硫代硫酸鈉滴定，同時做空白試驗。,實驗內(nèi)容,（一）從土壤中分離菌

3、種1、青霉素溶液的制備：稱取0.625g 160萬單位/0.96g青霉素溶解于10ml生理鹽水中，即得10萬單位/ml的青霉素。2、采集一個土壤樣品，約取10g，75℃水浴加熱20min，取1ml上層液稀釋1000倍，取1ml上層液到100ml（1000、2000、5000單位）液體培養(yǎng)基，封口搖床培養(yǎng)，即為實驗所用菌液。3、取菌液分別接種到1000單位，2000單位，5000單位的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。5.取5000單位

4、的菌，按照上述方法誘導(dǎo)至1萬單位。,實驗內(nèi)容,（二）篩選菌種1、挑取干燥的菌落（5000單位）進行革蘭氏染色，鏡檢，將形狀為桿狀的菌落標(biāo)上記號。（1）涂片（2）曬干（3）固定（4）染色（5）水洗（6）干燥（7）鏡檢2、將篩選出的菌種保存到斜面培養(yǎng)基（4℃）,實驗內(nèi)容,（三）酶活力的測定1、取菌體平板培養(yǎng)物，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，在25℃搖床培養(yǎng)24小時，取搖瓶培養(yǎng)基中菌液15ml，4000r/min離心15min，沉淀菌體，取上

5、清液保存。2、稱取青霉素鈉（鉀）適量，用磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，溶解成每1ml中含青霉素1萬單位的溶液。另取粗酶溶液，按估計單位用磷酸鹽緩沖液(pH7.0)稀釋1000倍，在37℃預(yù)熱。,實驗內(nèi)容,3、精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中，預(yù)熱至37℃后，精密加入已預(yù)熱的青霉素酶稀釋液25ml，迅速混勻，在37℃準(zhǔn)確放置1小時，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液(0.01mol/L) 25ml中,在室溫暗處放置

6、15分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液(0.01mol/L)滴定，至近終點時，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至顏色消失。4、取已預(yù)熱的青霉素溶液2ml，在37℃放置1小時，精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然后精密加粗酶稀釋液1ml，在室溫暗處放置15分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液(0.01mol/L)滴定。得空白滴定消耗。,實驗內(nèi)容,按下式計算：E＝(B－A)×M×F×D×100式中E為青霉素酶

7、活力，單位／(ml.小時)；B為空白滴定所消耗的上述硫代硫酸鈉滴定液的容量，ml；A為樣品滴定所消耗的上述硫代硫酸鈉滴定液的容量，ml；M為硫代硫酸鈉滴定液的濃度，mol/L；F為在相同條件下，每1ml的上述碘滴定液(0.01mol/L相當(dāng)于青霉素的效價單位（742）D為青霉素酶溶液的稀釋倍數(shù)。,實驗內(nèi)容,（四）誘變育種1、將之前保種的10000單位的菌種接種在250ml液體培養(yǎng)基里面搖床培養(yǎng)18h。2、將試管里的菌液稀釋

8、到100萬單位/ml。3、將稀釋后的菌液平鋪（約取3ml)在6個滅菌的空平板上，分別于紫外燈下照射0min、1min、3min、5min、7min、9min。4、取照射后的菌液分別涂布在含有青霉素10000單位/ml、15000單位/ml的固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱保存，之后觀察菌落生長情況。5、挑取長出來的菌落在液體培養(yǎng)基里面培養(yǎng)48h，取培養(yǎng)液進行測酶活，得出結(jié)論。,實驗結(jié)果,（一）從土壤中分離菌種,,5000單位,1000

9、 — 10000單位,實驗結(jié)果,（二）鏡檢,實驗結(jié)果,（三）酶活測定結(jié)果結(jié)果數(shù)據(jù)記錄：稀釋100倍滴定刻度變化 A 樣品 1.7—3.5 mL 1.8ml B 空白 2.0—4.1 mL 2.1ml硫代硫酸鈉滴定液濃度 0.01mol/L碘滴定液濃度 0.05mol/L計算：E=(B－A)×M×F×D×100

10、 =（2.1-1.8）×0.01×742×100×100 =22260單位,實驗結(jié)果,（四）紫外誘變結(jié)果 第一次做的誘變育種沒有長出菌落，因此重復(fù)了誘導(dǎo)步驟，培養(yǎng)48h后僅長出5min平板其余均未長菌。,總結(jié),1、實驗過程中嘗試很多菌株的誘變方法，平板篩選不成功后及時改進方案，改為液體培養(yǎng)基梯度培養(yǎng)，我們最終得到了耐10000μ青霉素的

11、菌株。經(jīng)過鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌株確實是桿菌，對此菌株進行了保存。2、在酶活力測定過程中，按藥典配制的滴定液濃度經(jīng)滴定測定不準(zhǔn)確，原因可能是沒有及時將硫代硫酸鈉避光保存，因而最終結(jié)果酶活力偏小。3、第一次紫外誘變后所有平板包括對照均沒有長菌，對菌株進行了第二次10000單位誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)其確實為所需要的菌株，于是進行了第二次誘導(dǎo)。 第二次誘導(dǎo)12h未長菌，48h后有些平板長了霉菌影響觀測，僅能看到紫外照射五分鐘平板長菌，但無法確定是否