赭曲霉毒素A致雞肝細(xì)胞損傷及四種常用護(hù)肝藥保護(hù)機(jī)理研究.pdf

1、赫曲霉毒素A(OTA)是毒性最大、產(chǎn)毒量最高、對農(nóng)產(chǎn)品污染最重的赫曲霉毒素，它廣泛存在于糧食、飼料和糧谷類食物等中。OTA具有腎毒性、肝毒性、致畸性、基因毒性、胚胎毒性等。OTA對家禽的毒性較強(qiáng)，主要引起肝臟損傷，但目前多集中于肝損傷癥狀報(bào)道，機(jī)理研究較少。因此，研究OTA致雞肝細(xì)胞損傷病理機(jī)制及護(hù)肝藥物修復(fù)效應(yīng)，具有重要的理論和實(shí)踐意義。本文藉體外雞原代肝細(xì)胞，研究OTA致雞肝細(xì)胞損傷病理演變及常用護(hù)肝藥的修復(fù)效應(yīng)及機(jī)理。主要研究內(nèi)容

2、和結(jié)果如下:
　　1.OTA誘導(dǎo)雞原代肝細(xì)胞損傷最佳劑量的篩選
　　采用改良的二步Ⅳ型膠原酶循環(huán)灌流法，對40-50日齡海藍(lán)公雞進(jìn)行肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)，待培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞貼壁。在貼壁細(xì)胞中分別加入0（對照組）、0.25、0.5、1、2、4μg/mL OTA(n=3)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，取肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液，檢測其中ALT、AST的含量，MTT法測定細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示:對照組細(xì)胞貼壁牢固，

3、呈多角形，核圓透亮，細(xì)胞聚集成島嶼狀生長，排列整齊。試驗(yàn)組細(xì)胞隨著OTA濃度的增大，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，密度下降，部分肝細(xì)胞破裂、壞死懸浮于培養(yǎng)基中，剩余細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散破碎。細(xì)胞存活率和ALT、AST的含量呈劑量依賴性的下降和上升。當(dāng)細(xì)胞中加入1μg/mL OTA培養(yǎng)24 h后，肝細(xì)胞存活率為51.33±4.27％,細(xì)胞上清液中ALT含量極顯著升高，AST含量顯著升高。當(dāng)OTA為2、4μg/mL時(shí)，細(xì)胞上清液中ALT、AST含量均極顯著升高

4、，細(xì)胞存活率較低;而0.25μg/mL OTA組，與對照組相比，ALT、AST的含量均無顯著性差異。故選擇OTA濃度1μg/mL作為致雞肝細(xì)胞損傷的最佳劑量。
　　2.OTA對雞原代肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及凋亡的研究
　　取正常培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，OTA組中更換含有1μg/mL OTA的培養(yǎng)基(n=3)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞。檢測各組細(xì)胞中SOD的活性、GSH和MDA的含量，測定細(xì)胞凋亡率及線粒體途徑相關(guān)基因Caspas

5、e-3，Bax，Bcl-2的表達(dá)量。結(jié)果顯示，與對照組相比，1μg/mL OTA可使細(xì)胞中SOD的活性和GSH的含量極顯著下降，MDA的含量極顯著升高，表明OTA可造成肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。通過流式細(xì)胞儀檢測凋亡率發(fā)現(xiàn)，OTA組細(xì)胞凋亡率顯著增加，可達(dá)32.06±2.11％（正常組細(xì)胞凋亡率為1.80±0.45％）。OTA組中Caspase-3，Bax表達(dá)量極顯著上升，Bcl-2表達(dá)量顯著降低，表明OTA可能是誘導(dǎo)線粒體途徑的凋亡。

6、r>　　3.復(fù)方甘草酸單胺、L-精氨酸、水飛薊素、葡醛內(nèi)酯對OTA致肝細(xì)胞損傷保護(hù)效應(yīng)
　　3.1復(fù)方甘草酸單胺、L-精氨酸、水飛薊素、葡醛內(nèi)酯對肝細(xì)胞膜的保護(hù)作用取正常培養(yǎng)24 h細(xì)胞，設(shè)置對照組，OTA致?lián)p組和四種護(hù)肝藥物高中低劑量組(0.1、1、10μg/mL)(n=3)。先加入護(hù)肝藥物預(yù)處理，然后加入OTA繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集各處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，檢測其中ALT、AST含量，MTT法測定細(xì)胞存活率，以此研究四種護(hù)肝藥

7、物對肝細(xì)胞膜的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，與OTA組相比，復(fù)方甘草酸單胺組和葡醛內(nèi)酯組隨藥物濃度的增大，細(xì)胞存活率升高，ALT的含量下降，呈現(xiàn)劑量依賴性。但復(fù)方甘草酸單胺各濃度組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AST的含量均無顯著變化，但整體呈現(xiàn)下降趨勢，葡醛內(nèi)酯則可使AST顯著下降，但各濃度組之間變化趨勢無規(guī)律可循。L-精氨酸組和水飛薊素組與OTA組相比，細(xì)胞存活率升高明顯，ALT含量顯著下降，但在低濃度下保護(hù)效果較好。水飛薊素組中AST含量顯著下降，但變化

8、無規(guī)律，L-精氨酸組則是在1μg/mL濃度下，AST含量下降最明顯。此結(jié)果表明，復(fù)方甘草酸單胺、L-精氨酸、水飛薊素和葡醛內(nèi)酯均有保護(hù)肝細(xì)胞膜的作用。
　　3.2復(fù)方甘草酸單胺、L-精氨酸、水飛薊素、葡醛內(nèi)酯的抗氧化作用取正常培養(yǎng)24 h細(xì)胞，設(shè)置對照組，OTA致?lián)p組和1μg/mL復(fù)方甘草酸單胺組、1μg/mL L-精氨酸組、1μg/mL水飛薊素組、1μg/mL葡醛內(nèi)酯組(n=3)。預(yù)先加入護(hù)肝藥物處理，再加入1μg/mL OTA

9、繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞，檢測細(xì)胞中SOD活性和GSH、MDA的含量。結(jié)果顯示，與OTA組相比，四種護(hù)肝藥物組均可升高SOD活性和GSH含量，降低細(xì)胞中MDA含量，其中尤以水飛薊素作用效果最好，此可表明四種護(hù)肝藥物均可通過抗氧化作用來抑制OTA導(dǎo)致的肝損傷。
　　3.3復(fù)方甘草酸單胺、L-精氨酸、水飛薊素、葡醛內(nèi)酯對肝細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測對照組，OTA致?lián)p組和1μg/mL復(fù)方甘草酸單胺組、1μg/mL L-精氨酸組

10、、1μg/mL水飛薊素組、1μg/mL葡醛內(nèi)酯組(n=3)中細(xì)胞的凋亡率，熒光定量PCR檢測線粒體凋亡途徑相關(guān)基因Caspase-3，Bcl-2，Bax的表達(dá)。結(jié)果顯示，與OTA組相比，經(jīng)四種護(hù)肝藥物預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡率下降顯著，尤以水飛薊素和復(fù)方甘草酸單胺抑制凋亡作用明顯。四種護(hù)肝藥均可在一定程度上降低Caspase-3，升高Bcl-2的表達(dá)，但L-精氨酸和葡醛內(nèi)酯對Bax的表達(dá)量無明顯降低作用，表明復(fù)方甘草酸單胺和水飛薊素可能是通過