赭曲霉毒素A誘導人胃黏膜上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化及可能機制的研究.pdf

1、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是由曲霉菌屬和青霉菌屬的某些菌株產(chǎn)生的一種真菌毒素，1993年國際癌癥研究中心IARC將OTA列為“可能的人類致癌物”。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)OTA具有腎毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性、致畸性、致突變性和致癌性等生物學效應。河北省贊皇縣是我國胃癌高發(fā)區(qū)，胃癌年均死亡率超過為77.67/10萬。2006年，我們對當?shù)鼐用窦Z食中OTA的污染狀況進行了現(xiàn)場調(diào)查，OTA檢出率為45.16％，最高含量為

2、14.25μg/kg，當?shù)鼐用馩TA的周暴露量為8.19μg/kg，明顯超過世界衛(wèi)生組織/糧農(nóng)組織聯(lián)合專家委員會(Joint FAO/WHO ExpertCommittee on Food Additives，JECFA)暫定的每周允許攝入量100 ng/kg。有關OTA研究最為廣泛的是在腎毒性或致癌性方面，本實驗組前期研究發(fā)現(xiàn)，OTA可以誘導人胃粘膜上皮(GES-1)細胞發(fā)生氧化應激損傷以及細胞周期紊亂;OTA可以導致人外周血單個核細

3、胞的氧化應激損傷。越來越多的體外和體內(nèi)的研究證明氧化應激在OTA的毒性和致癌作用方面具有重要作用。
　　大量研究認為氧化應激損傷是啟動和促進腫瘤發(fā)生的重要因素。當各種外源或內(nèi)源性因素引起的活性氧(ROS)超過體內(nèi)的清除能力時，就會導致ROS水平升高，使細胞內(nèi)的一些生物大分子（DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等）受到損傷，即發(fā)生氧化應激。在體內(nèi)或體外模型研究中對許多的分子機制進行了抗氧化作用研究通過消除OTA誘導的DNA損傷，脂質(zhì)過氧化作用，以

4、及細胞毒性進一步確認的OTA毒性和氧化損傷之間的聯(lián)系。有關OTA的毒性和OTA誘導腎癌形成提出的多種機制:抑制蛋白質(zhì)的合成，干涉代謝系統(tǒng)，增加膜脂質(zhì)過氧化反應，抑制線粒體呼吸和DNA損傷。我們在前期的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)急性染毒OTA后，人胃粘膜上皮細胞GES-1內(nèi)ROS水平明顯升高，引起細胞氧化DNA損傷。但是目前有關OTA是否可以誘導GES-1惡性轉(zhuǎn)化及氧化應激是否參與其中并不清楚。
　　近年來有研究顯示氧化應激在Wnt信號通路的激

5、活以及上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化中起了至關重要的作用。β-catenin一方面和E-cadherin結合形成復合體，與微絲、中間絲、肌動蛋白等細胞骨架相連，介導細胞間的黏附，參與調(diào)控細胞分化和組織發(fā)生;另一方面，β-catenin進入細胞核內(nèi)扮演轉(zhuǎn)錄因子的角色，β-catenin磷酸化阻止其與α-catenin的結合，導致其堆積于細胞核內(nèi)，此過程會降低細胞間黏附，同時β-catenin作為Wnt/β-catenin信號通路的關鍵分子，它的表達增加

6、可以激活Wnt信號通路的下游分子。Wnt/β-catenin信號通路是誘導惡性轉(zhuǎn)化過程中不可缺少的通路。有研究表明，飲水中砷、鉻誘導大腸癌發(fā)生的潛在機制就是ROS介導的Wnt/β-catenin信號通路的激活;ROS導致基因的不穩(wěn)定，進而導致了細胞惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生。我們不禁思考一個問題:OTA誘導的人胃黏膜上皮細胞氧化應激是否參與介導了Wnt信號通路的激活以及細胞的惡性轉(zhuǎn)化？
　　鑒于此，本研究利用永生化人正常胃黏膜上皮細胞(GES

7、-1)作為研究對象，研究和探討OTA長期染毒對GES-1細胞遷移、侵襲和克隆形成能力等方面的影響，并通過接種裸鼠成瘤進一步證明是否發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。利用Western blot印跡等技術探討長期暴露OTA后對GES-1細胞上皮性蛋白表達的影響;接著以Wnt/β-catenin通路作為切入點，利用蛋白印跡等技術揭示W(wǎng)nt通路在OTA誘導GES-1細胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用;然后基于抗氧化策略的實施，評價氧化應激對Wnt/β-catenin通路及細胞

8、惡性轉(zhuǎn)化的影響，從整體水平觀察OTA對胃粘膜上皮細胞的損傷作用，為揭示OTA與胃癌發(fā)生的關系提供科學依據(jù)。
　　第一部分赭曲霉毒素A長期染毒誘導人胃黏膜上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化
　　目的:探討赭曲霉毒素A誘導體外培養(yǎng)的GES-1細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的可能性，分析OTA誘導GES-1細胞惡性轉(zhuǎn)化的相關機制。
　　方法:
　　1分組及處理:在預實驗的基礎上，以長期染毒方法探討OTA處理誘導GES-1細胞惡性轉(zhuǎn)化作用。實驗分為OT

9、A處理組和對照組，取對數(shù)生長期GES-1細胞，用10％ DMEM調(diào)整細胞濃度為(1～2)×104個/L，接種于培養(yǎng)瓶，細胞培養(yǎng)24 h后，給予2.5μmol/L OTA處理72h，一周一次，染毒直至40代。2惡性轉(zhuǎn)化的評價:2.1采用形態(tài)學觀察OTA處理后細胞變化，劃痕實驗于顯微鏡下觀察細胞遷移情況，Transwell實驗在高倍鏡下計數(shù)PET膜下面侵襲的細胞數(shù)，軟瓊脂克隆觀察細胞錨著獨立性生長能力;2.2裸鼠成瘤實驗:實驗分為對照組(n

10、=10)，2.5μmol/L OTA處理組(n=10)，陽性對照BGC-823組(n=3)，4-6周齡雄性BALB/C-nu裸鼠，分別將100μl1×108/ml的細胞懸液皮下注射于裸鼠右側(cè)腋窩區(qū)，16周后處死小鼠。3成瘤標本檢測:取出皮下腫瘤，HE染色結果證實為接種瘤，免疫組織化學染色結果顯示為上皮來源。同時，提取裸鼠腫瘤組織總RNA和總蛋白，進行Western Blot和Real time PCR檢測上皮標志物cytokeratin

11、的表達情況。
　　結果:
　　1 OTA長期染毒GES-1細胞形態(tài)學觀察
　　倒置顯微鏡下觀察，對照組GES-1細胞呈單層生長，排列有序，形態(tài)為梭形，細胞核圓形其邊界清晰，細胞漿結構清晰。2.5μmol/L OTA染毒40代后細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞鏡下呈多角形，大小不一，細胞間排列緊密，可見多核巨細胞，并呈團塊狀生長，排列紊亂，很多細胞周邊多呈毛刺狀。
　　2 OTA對GES-1細胞遷移力的影響
　　采

12、用細胞劃痕實驗觀察OTA對GES-1細胞遷移力的影響。實驗結果表明，2.5μmol/L OTA染毒組在第10代與對照組相比無統(tǒng)計學差異，第20代時開始出現(xiàn)遷移速度增高，第30代細胞朝向劃痕遷移的速度明顯高于對照組細胞，至第40代細胞遷移速度明顯增高，與對照組有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。此外，采用Transwell方法觀察了OTA對GES-1細胞侵襲能力的影響，于接種后72小時計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)目并拍照記錄。2.5μmol/L OTA染

13、毒組在第40代時穿過膜的細胞數(shù)目427±12.02明顯高于對照組103±7.96，差異顯著(P＜0.05)。
　　3 OTA對GES-1細胞獨立錨著生長能力的影響
　　采用軟瓊脂克隆試驗檢測細胞獨立錨著生長能力，2.5μmol/L OTA染毒20代時細胞在軟瓊脂上可形成小的細胞集落，細胞以數(shù)十個左右聚集成團，但生長緩慢，不能進一步形成較大的克隆，達不到每個集落大于50個細胞的標準;至第30代時，2.5μmol/L OTA染毒

14、組細胞能在軟瓊脂上形成克隆并可見光滑輪廓的集落形成，但接種裸鼠并沒有成瘤;至第40代時，2.5μmol/L OTA染毒組細胞形成的克隆數(shù)目多并且大，接種裸鼠可見皮下腫瘤形成。
　　4裸鼠成瘤實驗
　　分別收集2.5μmol/L OTA染毒40代細胞，對照組細胞，陽性對照組胃癌細胞株BGC-823細胞，將1×107個不同組別的細胞皮下注射于每只裸鼠右側(cè)腋窩區(qū)，接種后3周時2.5μmol/L OTA染毒組10只中有6只接種部位出

15、現(xiàn)可見的腫塊，接種后16周時瘤塊的直徑達1.52-1.61cm左右，陽性對照組接種后1周全部出現(xiàn)腫瘤，接種后16周時瘤塊的直徑達1.94-2.35cm左右。與此同時，裸鼠體內(nèi)并沒有發(fā)現(xiàn)其他瘤塊，對照組小鼠皮下及體內(nèi)均沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤生成。
　　5裸鼠成瘤組織的病理形態(tài)學特點觀察
　　接種瘤組織行福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm切片，切片進行HE染色和免疫組化檢查，HE染色觀察2.5μmol/L OTA處理組和陽性對照組細胞形成的皮

16、下腫瘤組織無差異，均可見高分裂像，瘤細胞排列密集形狀近于卵圓形或多邊形。免疫組化顯示，上皮來源標志蛋白cytokeratin呈陽性表達。提取接種瘤組織的蛋白和RNA進行Western Blot和Real time PCR檢測上皮標志物cytokeratin，結果顯示cytokeratin呈現(xiàn)陽性表達。
　　綜上結果說明2.5μmol/L OTA染毒20代時遷移侵襲能力增強，克隆形成，可能是細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的早期關鍵階段;OTA染毒

17、30代時可見光滑輪廓的集落形成，但接種裸鼠并沒有成瘤;至第40代時，形成的克隆數(shù)目多并且大，接種裸鼠可見皮下腫瘤形成;證明2.5μmol/L OTA慢性染毒40代時誘導GES-1細胞發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化，進一步證實了OTA對人類細胞的致癌性。
　　第二部分 Wnt/β-catenin信號通路在赭曲霉毒素A長期染毒誘導胃黏膜上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用
　　目的:探討Wnt/β-catenin信號通路在赭曲霉毒素A誘導GES-1細胞惡性

18、轉(zhuǎn)化過程中的作用。
　　方法:
　　1分組及處理:實驗分為OTA處理組和對照組，取對數(shù)生長期GES-1細胞，用10％ DMEM接種于培養(yǎng)瓶，細胞貼壁生長至40-50％時，給予2.5μmol/L OTA處理72h，一周一次，分別取染毒10代，20代，30代和40代細胞進行實驗。2利用免疫共沉淀技術檢測2.5μM OTA染毒組和對照組細胞E-cadherin/β-catenin復合物表達情況。3利用激光共聚焦技術觀察β-cate

19、nin的核移位情況。4利用Western blot以及real-time PCR觀察Wnt/β-catenin信號通路中相關分子(Dvl、GSK3β、Wnt2、β-catenin、Tcf4、Lef1)的蛋白及mRNA表達情況。5采用Western Blot和Real time PCR方法檢測β-catenin siRNA干擾對Wnt/β-catenin信號通路中轉(zhuǎn)錄因子及細胞周期關鍵調(diào)控因子的影響。6給予Wnt信號通路的抑制劑DKK-1

20、，選用OTA染毒40代細胞，給予50nM預處理1h，觀察Wnt/β-catenin信號通路中分子的表達情況。
　　結果:
　　1 OTA長期染毒誘導GES-1惡性轉(zhuǎn)化過程中E-cadherin/β-catenin復合物形成情況
　　β-catenin最初是作為與細胞膜上鈣依賴性粘附分子E-cadherin相互作用的胞內(nèi)分子得以分離和克隆的，β-catenin通過與E-cacdherin形成復合物的功能主要是，參與細胞的

21、粘附、遷徙與轉(zhuǎn)移。采用免疫共沉淀技術檢測E-cadherin/β-catenin復合物形成，與對照組相比，2.5μM OTA染毒30代時復合物形成降低，染毒40代時復合物形成明顯降低(P＜0.05)。說明在惡性轉(zhuǎn)化過程中細胞膜上的β-catenin表達水平降低。
　　2 OTA長期染毒誘導GES-1惡性轉(zhuǎn)化過程中β-catenin的核移位情況
　　β-catenin不僅是細胞粘附分子，還是Wnt信號通路中重要的傳遞子。β-c

22、atenin出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位是Wnt信號通路活化的重要標志事件。通過激光掃描共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)于2.5μM OTA染毒20代時β-catenin出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位，染毒30代時核轉(zhuǎn)位較對照組明顯增加，染毒40代時與對照組比較，具有明顯統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　3 Wnt/β-catenin信號通路的激活在OTA長期染毒誘導GES-1惡性轉(zhuǎn)化過程中作用
　　在證明OTA處理能夠?qū)е娄?catenin核轉(zhuǎn)位的基礎上，進一步采用Real

23、-time PCR檢測了OTA處理不同時間GES-1細胞Wnt/β-catenin信號通路的重要成員wnt2、β-catenin、 GSK3β、Dvl、Tcf4和Lef1在mRNA水平上表達情況，結果顯示，2.5μmol/L OTA染毒20代前，上述Wnt/β-catenin信號通路關鍵分子的表達與對照組沒有明顯差異，OTA染毒30代時Wnt/β-catenin信號通路中關鍵分子的表達較對照組出現(xiàn)差異，當OTA染毒40代時Wnt/β-c

24、atenin信號通路中分子Wnt2、β-catenin、Tcf4、Lef1 mRNA的表達水平均明顯高于對照組，而Dvl和GSK3β mRNA的表達水平明顯則明顯低于對照組(P＜0.05)。
　　Western Blot檢測結果顯示，2.5μM OTA染毒30代時Wnt/β-catenin信號通路中具有活性的磷酸化的p-Dvl和p-GSK3β蛋白表達水平增加，OTA染毒40代時Wnt信號通路關鍵分子(Wnt2、β-catenin、

25、Tcf4、Lef1)蛋白表達較對照組具有顯著差異(P＜0.05)，而失活的Dvl，GSK3β蛋白表達較對照組明顯降低(P＜0.05)。
　　表明OTA誘導GES-1細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中Wnt/β-catenin信號通路被激活。
　　進一步證實了Wnt/β-catenin信號通路在OTA誘導的細胞惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。
　　4 siRNA干擾對GES-1細胞Wnt通路的影響
　　β-catenin siRNA以及C

26、ontrol siRNA轉(zhuǎn)染OTA處理40代細胞48小時后收集細胞。Real-time PCR和Western blot結果顯示:β-catenin siRNA可以顯著降低GES-1細胞β-catenin mRNA和蛋白的表達。上述結果表明，β-catenin siRNA序列可以明顯干擾β-catenin在mRNA和蛋白水平的表達。因此，后續(xù)的實驗中繼續(xù)選擇該siRNA序列進行研究。
　　Western Blot檢測結果顯示，與C

27、ontrol siRNA+2.5μM OTA處理組相比，β-catenin siRNA+2.5μM OTA處理組轉(zhuǎn)錄因子Tcf4和Lef1的蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05)。同時檢測Wnt通路的靶基因CyclinD1、CDK4蛋白表達較對照組亦明顯降低(P＜0.05)，提示β-catenin siRNA干擾可以阻斷OTA誘導的GES-1細胞Wnt信號通路轉(zhuǎn)錄因子的表達進而逆轉(zhuǎn)OTA誘導的GES-1細胞增殖能力增強。
　　綜上結

28、果表明，長期OTA染毒引起GES-1細胞惡性轉(zhuǎn)化中Wnt信號通路活化，促進TCF核轉(zhuǎn)錄，誘導細胞周期蛋白的表達,從而使細胞獲得惡性增殖的能力。
　　5 DKK-1預處理在GES-1細胞Wnt/β-catenin通路激活中的作用
　　以上研究結果表明，OTA染毒40代時Wntβ-catenin信號通路激活，通過給予Wnt通路特異抑制劑DKK-1預處理從正反兩方面驗證Wnt信號通路的活化。Western Blot結果顯示，2.5

29、μM OTA染毒40代時，給予Wnt特異性抑制劑DKK-1預處理后Wnt/β-catenin信號通路中關鍵分子Wnt2、β-catenin、Tcf4、Lef1的蛋白表達水平較單獨OTA處理組明顯下降(P＜0.05)。表明DKK-1可以阻斷OTA誘導的Wnt通路激活。
　　進一步阻斷證明，Wnt/β-catenin信號通路的激活參與了OTA引起GES-1細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化過程。
　　第三部分氧化應激在OTA長期染毒誘導的胃黏膜上

30、皮細胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及其機制
　　目的:揭示OTA誘導的氧化應激在GES-1細胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及分子機制。
　　方法:
　　1分組及處理:取對數(shù)生長期GES-1細胞，分為對照組，OTA處理組和抗氧化組，用10％ DMEM調(diào)整細胞濃度為(1～2)×104個/L，接種于培養(yǎng)瓶，細胞培養(yǎng)24 h后，分別給予2.5μmol/L OTA處理72h，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)4mM預處理1 h+2.5μmol/L OT

31、A處理72h，一周一次，染毒直至40代。2對照組，2.5μmol/L OTA處理組，NAC+2.5μmol/L OTA處理組細胞子染毒10代，20代，30代和40代時采用熒光探針DCFH-DA和DHE檢測細胞內(nèi)ROS含量的變化。2采用超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)測試盒檢測OTA染毒10代，20代，30代和40代時細胞SOD活性及MDA含量的變化。3觀察2.5μmol/L OTA處理組，NAC+2.5μmol/L OTA處理

32、組細胞在染毒30和40代時克隆形成情況，裸鼠成瘤情況。2采用Western Blot和Real-time PCR方法檢測Wnt/β-catenin信號通路相關分子的表達情況。
　　結果:
　　1 OTA長期染毒誘導GES-1惡性轉(zhuǎn)化過程中ROS水平的變化
　　OTA的毒性和致癌性已經(jīng)證實與氧化應激損傷有關，流式細胞術檢測結果顯示，2.5μM OTA染毒20代前DCF、 DHE平均熒光強度較對照組有變化但無統(tǒng)計學差異，O

33、TA染毒30代DCF、DHE平均熒光強度明顯高于對照組(P＜0.05);為了進一步明確OTA通過氧化應激誘導GES-1細胞惡性轉(zhuǎn)化，實驗采用抗氧化劑NAC預處理來減少ROS。OTA染毒40代，抗氧化劑NAC+2.5μmol/L OTA處理組與單獨OTA處理組相比，DCF、DHE平均熒光強度明顯減低（P＜0.05）。結果顯示，OTA誘導GES-1細胞ROS生成增多，NAC緩解了OTA促ROS升高作用。
　　2 OTA對GES-1細胞

34、SOD活性和MDA含量的影響
　　SOD活性檢測結果表明，2.5μMOTA染毒30代時SOD活性為30.58±2.59 U/mg protein，顯著低于對照組119.11±7.55U/mg protein(P＜0.05); NAC+OTA處理組SOD活性較單獨OTA處理組明顯升高（66.68±5.61 vs30.58±2.59 U/mg protein，P＜0.05）。與對照組比較，OTA處理組MDA含量顯著升高(P＜0.05)

35、，NAC+OTA處理組較單獨OTA處理組明顯降低(P＜0.05，F(xiàn)ig.2B)。說明OTA可以引起GES-1細胞明顯的脂質(zhì)過氧化損傷。
　　3 NAC預處理對OTA長期染毒GES-1細胞獨立錨著生長能力的影響
　　軟瓊脂克隆試驗證明，OTA染毒30代時2.5μmol/L OTA組細胞能在軟瓊脂上形成克隆，NAC+2.5μmol/L OTA處理組與2.5μmol/L OTA處理組相比，形成的集落明顯減少，OTA染毒40代時，與

36、2.5μmol/L OTA處理組比較，NAC+2.5μmol/L OTA處理組形成的克隆數(shù)目及光滑輪廓的集落形成減小。
　　4 NAC預處理對OTA誘導惡性轉(zhuǎn)化細胞荷瘤裸鼠模型的影響
　　分別收集2.5μmol/L OTA染毒40代細胞，NAC+2.5μmol/L OTA染毒40代細胞，對照組細胞，將1×107個不同組別的細胞皮下注射于每只裸鼠右側(cè)腋窩區(qū)，接種后3周時OTA處理組10只中有6只接種部位可見皮下瘤塊，接種后5周

37、時NAC+ OTA處理組10只中有3只接種部位出現(xiàn)瘤塊，接種后16周時OTA處理組瘤塊的直徑達1.52-1.61cm左右，NAC+ OTA處理組瘤塊的直徑在0.58-0.67cm左右。
　　5 NAC預處理對OTA誘導的惡性轉(zhuǎn)化細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響
　　大量研究顯示致癌物的致癌機制之一就是氧化應激介導的Wnt信號通路的激活。Western Blot方法顯示,2.5μmol/L OTA處理組相比，NAC

38、+OTA染毒40代時Wnt/β-catenin信號通路相關分子的水平明顯降低(P均＜0.05)。Real-time PCR檢測結果顯示，與2.5μmol/L OTA染毒相比，NAC+染毒組均具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。
　　6 DKK-1預處理在OTA引起氧化應激介導的GES-1細胞Wnt通路激活中的作用
　　Western Blot結果顯示，NAC+OTA染毒40代時，給予Wnt信號通路特異性抑制劑DKK-1預處理后

39、Wnt/β-catenin信號通路中關鍵分子Wnt2、β-catenin、P-Gsk3β的蛋白表達水平較單獨OTA處理組明顯下降(P＜0.05)。表明DKK-1可以阻斷氧化應激介導的Wnt/β-catenin信號通路激活。
　　綜上結果表明，應激介導Wnt/β-catenin信號通路活化進而參與OTA慢性染毒誘導的GES-1細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。
　　結論:
　　1 OTA慢性染毒能夠誘導GES-1細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，細胞遷

40、移、侵襲和克隆形成能力增強，并可致裸鼠成瘤。
　　2 OTA慢性染毒能夠誘導GES-1細胞Wnt/β-catenin信號通路的激活。
　　3 Wnt/β-catenin信號通路活化促進核轉(zhuǎn)錄，誘導細胞周期蛋白的表達，從而使細胞獲得惡性增殖的能力。
　　4氧化應激參與了OTA慢性染毒誘導GES-1細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化過程。
　　5給予氧化應激拮抗劑NAC可以降低OTA誘導GES-1細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化作用。
　　6氧