利用谷氨酸棒桿菌中血紅素合成途徑積累5-氨基乙酰丙酸的研究.pdf

1、5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinate，ALA)，是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，同時也是吡咯化合物如卟啉、血紅素、維生素B12、葉綠素等合成的重要中間物質(zhì)，并且普遍存在于細(xì)菌、真菌、植物和動物中。ALA作為一種光動力化學(xué)試劑廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，ALA作為一種光動力化學(xué)試劑廣泛的用于腸胃科、泌尿科和皮膚科等，同時還作為一種光敏劑應(yīng)用于各種癌癥的光動力診斷和光動力治療。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，低濃度的ALA能提高植物的抗寒性

2、和耐鹽性，還能作為一種容易降解的具有選擇性的除草劑和殺蟲劑。
　　目前，ALA主要通過化學(xué)法合成，但是化學(xué)法合成步驟繁瑣、分離提純難、產(chǎn)量低，并且污染環(huán)境。隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者們開始集中于利用微生物細(xì)胞工廠來合成ALA，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)ALA的方法環(huán)保、安全、節(jié)能并且是可持續(xù)的，這可能是生產(chǎn)ALA的未來的發(fā)展趨勢。許多研究利用紅假單胞菌或大腸桿菌的代謝工程以及基因工程等技術(shù)來生產(chǎn)ALA，并且大部分研究集中于ALA的C4

3、合成途徑。但是，在C4途徑的工藝研究中需要添加前體物質(zhì)琥珀酸和甘氨酸，而這兩種物質(zhì)也是通過化學(xué)合成法制備的，從而使生物轉(zhuǎn)化ALA的生產(chǎn)成本較高。另外，如果甘氨酸的濃度高于1.7 g/L，會對菌體的生長產(chǎn)生抑制作用，從而使生物轉(zhuǎn)化工藝變得比較復(fù)雜。在這些工藝研究中所用的培養(yǎng)基為昂貴的LB培養(yǎng)基，這也成為ALA生物轉(zhuǎn)化工業(yè)化的瓶頸。目前，有研究利用大腸桿菌的C5途徑來合成ALA，并且ALA產(chǎn)量能達(dá)到4.13 g/L。C5途徑與C4途徑相比，

4、具有可以直接利用廉價的葡萄糖進(jìn)行代謝來合成ALA的優(yōu)勢。但是大腸桿菌只是模式菌株，并不是安全菌株，同時，ALA的C5合成途徑的前體是谷氨酸，如果采用能大量分泌谷氨酸并且具有食品安全性的菌株谷氨酸棒桿菌的話，直接以葡萄糖作為碳源，不僅能降低生產(chǎn)成本，還能簡化發(fā)酵工藝途徑。
　　谷氨酸棒桿菌（Corynebaererium glutamicum）是從土壤中分離得到的革蘭氏陽性菌，被廣泛的用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)谷氨酸和其它氨基酸，最近也有

5、研究報道被用來生產(chǎn)一些其它具有應(yīng)用價值的有機(jī)酸、胺類和生物能源等。由于谷氨酸棒桿菌在工業(yè)生物技術(shù)中的重要性，被作為一種模式菌株用于研究原核生物的代謝與調(diào)控，同時還作為一種工具用于合成生物學(xué)的研究。因?yàn)锳LA的C5合成途徑的前體是谷氨酸，而谷氨酸棒桿菌不僅能天然分泌谷氨酸，還是一株食品安全菌株，所以我們考慮以谷氨酸棒桿菌作為宿主菌用于積累ALA，這對進(jìn)一步開發(fā)ALA的醫(yī)藥價值具有一定的積極作用。
　　含有鐵離子的四吡咯化合物血紅素(

6、heme)作為許多酶的輔助因子起重要的作用，尤其是作為參與電子傳遞鏈的細(xì)胞色素氧化酶的輔助因子。盡管heme的合成在呼吸產(chǎn)能的過程中起重要的作用，但是heme合成過量會對菌體產(chǎn)生一定的毒性。以ALA作為前體的heme合成途徑在許多生物體內(nèi)是高度保守的。但是，在不同的生物體內(nèi)，ALA的合成可能在不同程度上會受到heme的反饋抑制。在谷氨酸棒桿菌中，通過生物信息學(xué)分析了以谷氨酸作為前體合成ALA的3個關(guān)鍵基因gltX、 hemA和hemL，

7、主要進(jìn)行了3個基因的氨基酸序列比對并找出了它們的功能結(jié)構(gòu)域。通過與大腸桿菌中GluRS、HemA和HemL氨基酸序列的分析比較得出，它們的同源性分別為31.53％、25.32％和47.05％，所以需要進(jìn)一步對谷氨酸棒桿菌中的glt、hemA和hemL進(jìn)行功能驗(yàn)證。
　　在本研究中，我們首先從谷氨酸棒桿菌的基因組中分離得到了heme合成途徑中用于合成ALA的三個關(guān)鍵基因gltX、 hemA和hemL，然后通過氨基酸序列比對、互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

8、及發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這三個基因。結(jié)果表明，這三個關(guān)鍵基因gltX、 hemA和hemL分別用來編碼谷氨酰-tRNA合成酶、谷氨酰tRNA還原酶和谷氨酰-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶。在谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)，與對照相比，過表達(dá)gltX和hemL并沒有提高ALA的積累。但是，在過表達(dá)hemA后，ALA的積累明顯地提高，推測將谷氨酰tRNA催化還原為谷氨酰-1-半醛的谷氨酰tRNA還原酶HemA的反應(yīng)有可能是限速反應(yīng)。在谷氨酸棒桿菌中協(xié)同表達(dá)內(nèi)

9、源的hemA和hemL后，ALA的積累進(jìn)一步提高，初步表明谷氨酸棒桿菌具有研究和生產(chǎn)ALA的潛力。為了進(jìn)一步提高ALA的積累，協(xié)同表達(dá)不同其它來源的hemA和hemL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，來源于亞利桑那沙門氏菌的突變基因hemAM在谷氨酸棒桿菌中的酶活性比較高，在與來源于大腸桿菌中的hemL共表達(dá)后明顯的提高了ALA的產(chǎn)量。而低產(chǎn)量的乳酸和乙酸對ALA的生產(chǎn)有一定的積極作用。為了分析影響ALA積累的因素，我們在基因表達(dá)水平上進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。

10、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，影響ALA合成的關(guān)鍵因素可能是溶氧水平和Fe2+濃度。為了解決這一問題，對Fe2+濃度和溶氧水平進(jìn)行了優(yōu)化，并且發(fā)現(xiàn)隨著Fe2+濃度和溶氧水平的降低，ALA的積累不斷的提高。另外，為了降低下游heme途徑的合成，我們首次添加了除乙酰丙酸以外的其它各種抑制劑，并在heme合成途徑的關(guān)鍵基因hemB的末端添加弱化標(biāo)簽。結(jié)果表明，在一定程度上抑制ALA的下游合成途徑會影響菌體的生理代謝，并能促進(jìn)ALA的積累，而通過搖瓶發(fā)酵

11、使ALA的積累達(dá)到1.79 g/L。
　　雖然在谷氨酸棒桿菌中共表達(dá)不同來源的hemA和hemL能有效的提高ALA的積累，但是ALA的積累對菌體的代謝及生長產(chǎn)生了一些影響。較低的生長速率和葡萄糖消耗速率可能就是因?yàn)檫策衔镆约癶eme的積累達(dá)到一定濃度后引起的。為了進(jìn)一步了解這些影響和變化，進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序的分析與比較。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的結(jié)果顯示，在共表達(dá)不同來源的hemA和hemL后，糖酵解途徑下調(diào)，而TCA循環(huán)、PPP途徑和呼

12、吸代謝途徑是上調(diào)的。推測糖酵解途徑下調(diào)后使代謝流流向產(chǎn)生NADPH的PPP途徑，從而使NADPH的積累提高，然后參與需要以NADPH作為輔助因子的HemA的催化合成。同時，呼吸速率的提高可能會促進(jìn)TCA循環(huán)的提高，而TCA循環(huán)提高后，會降低代謝溢流如乙酸的合成。而呼吸速率和TCA循環(huán)的提高會促進(jìn)電子傳遞鏈的電子傳遞和能量產(chǎn)生。另外，幾個參與heme合成途徑的基因的表達(dá)量發(fā)生了上調(diào)，同時，編碼雙組份系統(tǒng)HrrSA的兩個基因的表達(dá)量也上調(diào)，

13、結(jié)果表明雙組份系統(tǒng)HrrSA的表達(dá)量提高后可能用于調(diào)控上調(diào)的heme合成途徑，并且間接表明heme進(jìn)行了積累并影響了細(xì)胞內(nèi)的生理代謝。另外，結(jié)合文獻(xiàn)報道以及根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對heme下游合成途徑的分析，推測heme下游的合成途徑的調(diào)控是比較復(fù)雜的，并且可能是影響ALA積累的關(guān)鍵因素?？傊诠劝彼岚魲U菌中過表達(dá)外源的hemA和hemL對菌體的基本代謝途徑產(chǎn)生了一定的影響，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，我們不僅了解ALA的積累對菌體所產(chǎn)生的代謝途徑的

14、影響與調(diào)控，同時還為進(jìn)一步提高ALA的積累提供了理論指導(dǎo)。
　　既然在共表達(dá)不同來源的hemA和hemL后，雙組份系統(tǒng)能參與heme合成途徑的調(diào)控，我們進(jìn)一步研究分析了谷氨酸棒桿菌中的雙組份系統(tǒng)。雖然heme不僅是參與呼吸代謝途徑的細(xì)胞色素氧化酶的輔助因子，同時也是參與某些中心代謝途徑的酶的輔助因子。但是，如果heme的濃度超過一定閾值會對菌體產(chǎn)生一定的毒性。在谷氨酸棒桿菌中，雙組份系統(tǒng)HrrSA和ChrSA在heme的平衡中起重

15、要的調(diào)控作用。當(dāng)heme存在并達(dá)到一定濃度時，HrrSA會調(diào)控heme的降解以及以heme作為輔助因子的細(xì)胞色素氧化酶的合成，用來降低heme的合成，而ChrSA主要是激活轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因hrtBA的表達(dá)，將heme轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。為了降低細(xì)胞內(nèi)所產(chǎn)生的heme對菌體自身所產(chǎn)生的影響，我們過表達(dá)了內(nèi)源基因hmuO和hrtBA，并且在添加抑制劑后，ALA的積累達(dá)到1000 mg/L左右，更重要的是，該重組菌株的生長速率和葡萄糖消耗也有所提高。<

16、br>　　本論文首次通過谷氨酸棒桿菌的heme合成途徑來提高ALA的積累。我們首先克隆得到參與heme合成途徑的關(guān)鍵基因gltX、hemA和hemL，并進(jìn)行了序列與功能驗(yàn)證。共表達(dá)不同來源的hemA和hemL雖然提高了ALA的積累，但是出現(xiàn)了生長速率和葡萄糖消耗速率慢等現(xiàn)象，所以我們通過轉(zhuǎn)錄組分析找出了影響ALA積累的關(guān)鍵影響因素溶氧水平和Fe2+濃度，然后進(jìn)行了優(yōu)化并進(jìn)一步提高了ALA的積累。通過添加包括乙酰丙酸在內(nèi)的各種ALAD抑制