IL-17A對(duì)哮喘氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥的影響及其免疫機(jī)制研究.pdf

1、支氣管哮喘（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“哮喘”）是一種具有明顯異質(zhì)性的慢性氣道炎癥性疾病。哮喘具有可逆性的氣流受限、氣道高反應(yīng)性和慢性氣道炎癥等臨床特征。根據(jù)哮喘的臨床特征不同可以分為不同的臨床表型，如過(guò)敏性和非過(guò)敏性哮喘等等。不同臨床表型的哮喘其發(fā)病機(jī)制也有所不同，即存在“哮喘內(nèi)型”差別。不同的內(nèi)型可能解釋不同哮喘“表型”的病理生理過(guò)程。目前發(fā)現(xiàn)內(nèi)型為“Th2增高(Th2-high)”的患者，表現(xiàn)為過(guò)度增強(qiáng)的Th2型免疫應(yīng)答，Th2細(xì)胞過(guò)度活化及其相關(guān)

2、細(xì)胞因子IL-4、IL-5等的產(chǎn)生增多，同時(shí)氣道以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主。臨床上的過(guò)敏性哮喘為“Th2增高”的內(nèi)型，通常由吸入的過(guò)敏原所誘發(fā)，具有明顯的Th2型免疫反應(yīng)，同時(shí)伴有氣道內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞聚集，氣道平滑肌的增生，以及血清IgE的升高。
　　IL-17A是一種主要由Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，Th17細(xì)胞具有明顯區(qū)別于Th1、Th2細(xì)胞的特征，其分化受到IFN-γ和IL-4的負(fù)性調(diào)控。IL-17A的主要生物

3、學(xué)作用是在機(jī)體內(nèi)通過(guò)引起中性粒細(xì)胞的聚集、活化，參與抵抗病原體的感染以及風(fēng)濕類(lèi)疾病等。IL-17A是參與中性粒細(xì)胞炎癥非常重要的細(xì)胞因子。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者的血和肺中IL-17A因子的濃度增高，并且和哮喘的嚴(yán)重程度相關(guān)，提示IL-17A可能參與了哮喘慢性氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展，特別是與中性粒細(xì)胞性哮喘有關(guān)。
　　國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究中發(fā)現(xiàn)IL-17A具有促炎效應(yīng)以及一定的抑炎效應(yīng)，即IL-17A可能存在雙重效應(yīng)，研究中抑制炎癥的效應(yīng)可

4、能是低濃度IL-17A所引起的。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)，利用IL-17A基因敲除小鼠建立OVA誘導(dǎo)的哮喘模型同時(shí)給予LPS氣道干預(yù)時(shí)較野生鼠的氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥增高及脾臟Th2細(xì)胞分化增多。因此，我們假設(shè)IL-17A能通過(guò)直接抑制Th2細(xì)胞分化，減輕哮喘小鼠的氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥。本研究通過(guò)OVA致敏和激發(fā)建立氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的哮喘小鼠模型，并觀察IL-17A對(duì)哮喘小鼠氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥以及Th2型免疫的影響及其機(jī)制。
　

5、　研究目的:
　　1.探索IL-17A在哮喘小鼠氣道炎癥中的作用，包括肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度以及BALF中細(xì)胞分類(lèi)和細(xì)胞因子的變化。
　　2.探索IL-17A在哮喘小鼠支氣管淋巴結(jié)和脾臟以及體外培養(yǎng)中的Th2細(xì)胞分化中的作用。
　　研究方法:
　　第一章 IL-17A對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的影響
　　1.OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型的建立及氣道干預(yù)處理
　　實(shí)驗(yàn)分為三組，即對(duì)照組、模型組、IL-17A處理組。在

6、建模第1、7天，模型組和IL-17A處理組小鼠腹腔注射OVA致敏，第14-18天用1％ OVA霧化1h激發(fā)，對(duì)照組均予以等量生理鹽水;IL-17A處理組小鼠每次激發(fā)前1h麻醉后氣道滴入100 ng IL-17A，對(duì)照組及模型組予以等量生理鹽水。
　　2.BALF、肺組織標(biāo)本的檢測(cè)
　　收集BALF液計(jì)細(xì)胞總數(shù)，離心后上清用ELISA法檢測(cè)IL-4、IL-5、INF-γ、 IL-17A濃度，所得沉淀涂片后染色行分類(lèi)計(jì)數(shù);左肺切

7、片后行HE及PAS染色，于顯微鏡下觀察進(jìn)行半定量評(píng)分。
　　第二章 IL-17A對(duì)哮喘Th2細(xì)胞分化的抑制作用及機(jī)制
　　1.小鼠支氣管淋巴結(jié)及脾臟Th細(xì)胞分化的檢測(cè)
　　制備淋巴結(jié)和脾臟單細(xì)胞懸液，刺激培養(yǎng)后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1/2/17的分化比例。
　　2.IL-17A在體外誘導(dǎo)幼稚CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化中的抑制作用
　　制備脾臟單細(xì)胞懸液，用免疫磁珠分選幼稚CD4+T細(xì)胞，用分化因子液加或

8、者不加30 ngIL-17A同完全培養(yǎng)基一起培養(yǎng)細(xì)胞。在48h洗滌細(xì)胞后，用僅含IL-2的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至96h。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)24h、96h時(shí)Th細(xì)胞分化。利用AnnexinV/PI法檢測(cè)孵育24h時(shí)細(xì)胞凋亡程度。相同的培養(yǎng)條件下利用CCK8法比較培養(yǎng)24h時(shí)的增殖活力。
　　研究結(jié)果:
　　第一章 IL-17A對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的影響
　　1.BALF中細(xì)胞總數(shù)及各類(lèi)細(xì)胞計(jì)數(shù)及其比例的比較
　　模

9、型組較對(duì)照組小鼠BALF中的細(xì)胞總數(shù)高，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，IL-17A處理組小鼠的BALF細(xì)胞總數(shù)明顯低于模型組小鼠(P＜0.05);模型組BALF嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)(P＜0.05)和比例(P＜0.01)明顯高于對(duì)照組，而IL-17A處理組嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)(P＜0.05)及其比例(P＜0.01)明顯低于模型組，但I(xiàn)L-17A處理組嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)及其比例仍高于對(duì)照組(P＜0.01);模型組及IL-17A處理組中性粒細(xì)胞數(shù)及淋

10、巴細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.小鼠肺部支氣管和血管周?chē)装Y浸的比較
　　對(duì)照組小鼠肺部未見(jiàn)有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);模型組較對(duì)照組小鼠的支氣管周?chē)脱苤車(chē)懈黠@的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，半定量評(píng)分更高(P＜0.01);予以IL-17A氣道滴入后，IL-17A處理組小鼠支氣管周?chē)脱苤車(chē)装Y浸潤(rùn)程度明顯低于模型組小鼠，且炎癥評(píng)分有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);相比對(duì)照組，IL-17A處理

11、組小鼠肺部的炎癥浸潤(rùn)仍較顯著(P＜0.01)。
　　3.小鼠氣道杯狀細(xì)胞化生程度及半定量評(píng)分比較
　　對(duì)照組小鼠的氣道中未見(jiàn)明顯的杯狀細(xì)胞化生;模型組小鼠氣道中較對(duì)照組可見(jiàn)更多的PAS陽(yáng)性細(xì)胞，半定量評(píng)分具有顯著差異(P＜0.01);IL-17A處理組較模型組小鼠的氣道中杯狀細(xì)胞化生程度低(P＜0.01)。
　　4.小鼠BALF中Th相關(guān)細(xì)胞因子的比較
　　模型組小鼠BALF上清中的Th1相關(guān)因子IFN-γ濃度顯

12、著低于對(duì)照組(P＜0.01)，Th2相關(guān)因子IL-4、IL-5濃度顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，IL-17A濃度也顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);IL-17A處理組小鼠BALF中IL-4、IL-5濃度顯著低于模型組(P＜0.01)，IL-17A濃度顯著高于模型組(P＜0.01)，兩組之間IFN-γ濃度無(wú)顯著差異(P＞0.05);IL-17A處理組小鼠IL-4(P＜0.01)、IL-5(P＜0.05)濃度仍顯著高于對(duì)照組，IFN-γ濃度

13、顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，IL-17A濃度也顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。
　　第二章 IL-17A對(duì)哮喘Th2細(xì)胞分化的抑制作用及機(jī)制
　　1.小鼠支氣管淋巴結(jié)中Th細(xì)胞分化的比較
　　模型組小鼠淋巴結(jié)中Th1比例低于對(duì)照組(P＜0.01)，Th2比例高于對(duì)照組(P＜0.05)，兩組之間Th17比例無(wú)顯著性差異(P＞0.05);IL-17A處理組較模型組小鼠有更低的淋巴結(jié)Th2比例(P＜0.05)，兩組Th1

14、和Th17比例之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);IL-17A處理組Th2比例顯著高于對(duì)照組小鼠(P＜0.05)，Th1比例顯著低于對(duì)照組小鼠(P＜0.01)，兩組小鼠Th17比例之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.小鼠脾臟Th細(xì)胞分化程度比較
　　模型組小鼠脾臟Th1比例低于對(duì)照組(P＜0.01)，Th2比例顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，兩組Th17比例之間無(wú)顯著差異(P＞0.05);給予IL-17A氣道滴

15、入后，IL-17A處理組小鼠脾臟Th2比例顯著低于模型組(P＜0.01)，兩組之間Th1和Th17均無(wú)顯著差異(P＞0.05);IL-17A處理組小鼠脾臟Th1細(xì)胞比例仍低于對(duì)照組(P＜0.01)，兩組之間Th17比例差異不顯著(P＞0.05)。
　　3.IL-17A在體外誘導(dǎo)幼稚CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化中的抑制作用
　　在24h時(shí)，Th2極化組和Th2+IL-17A極化組之間細(xì)胞凋亡和增殖均無(wú)顯著差異(P＞0.05)

16、。Th2+IL-17A極化組中Th2細(xì)胞分化比例在培養(yǎng)24h時(shí)較Th2極化組呈下降趨勢(shì)(P＞0.05)，在培養(yǎng)至96h，IL-17A明顯抑制Th2細(xì)胞分化(P＜0.01)。
　　研究結(jié)論:
　　1.給OVA復(fù)制的哮喘模型氣道滴入IL-17A后可減輕肺部嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和降低BALF中Th2相關(guān)因子IL-4、IL-5的濃度。而且，不導(dǎo)致氣道中性粒細(xì)胞炎癥。
　　2.哮喘小鼠中支氣管淋巴結(jié)和脾臟的Th2細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照

17、組，IL-17A氣道滴入后可以降低Th2細(xì)胞分化比例，而不影響Th1細(xì)胞比例。IL-17A在體外還可抑制幼稚CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，而對(duì)其增殖和凋亡無(wú)顯著影響。
　　研究意義:
　　哮喘的“衛(wèi)生學(xué)說(shuō)”認(rèn)為，兒童時(shí)期接觸細(xì)菌內(nèi)毒素等可以通過(guò)刺激Th1細(xì)胞分化，來(lái)抑制Th2的分化，改善Th2/Th1失衡，從而減少哮喘的發(fā)病。本文的研究證實(shí)了，通過(guò)氣道內(nèi)給予IL-17A處理，也可以抑制Th2的分化，改善哮喘氣道的嗜酸細(xì)胞性