CD69在小鼠嗜酸性粒細(xì)胞中的表達(dá)及其抗體對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的抑制作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景: 嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)是哮喘發(fā)病機(jī)制中最重要的炎癥效應(yīng)細(xì)胞.Eos在氣道的浸潤與活化與哮喘的嚴(yán)重程度及氣道高反應(yīng)性(AHR)的進(jìn)展相關(guān), IL-5缺陷鼠進(jìn)一步證實(shí)了氣道Eos的浸潤與粘液分泌、AHR的內(nèi)在聯(lián)系.哮喘氣道慢性炎癥本質(zhì)為氣道Eos的激活與凋亡障礙.誘導(dǎo)氣道活化Eos凋亡是治療哮喘的關(guān)鍵.目前哮喘的急性發(fā)作仍需應(yīng)用全身激素.它可非特異性地作用于所有細(xì)胞并抑制皮質(zhì)軸反應(yīng)導(dǎo)致全身副作用,這給它的應(yīng)用帶來限制,特別是兒童

2、和青少年哮喘患者的治療:此外,還有少部分病人是激素抵抗型的.因此,尋找特異性誘導(dǎo)氣道活化Eos凋亡的藥物仍是全球研究工作者的艱巨任務(wù).細(xì)胞表面抗原CD69的發(fā)現(xiàn)為這一需求帶來了新的希望.CD69于1981年發(fā)現(xiàn),早期被稱為AIM、EA-1、LEU-23、MLR-3等,被認(rèn)為是T細(xì)胞的活化標(biāo)記物,在T細(xì)胞活化后1小時(shí)即有表達(dá),并可持續(xù)至72小時(shí),對(duì)T細(xì)胞的增殖分化有一定的作用.后來的研究發(fā)現(xiàn)CD69可在幾乎所有髓系細(xì)胞中表達(dá).CD69通常

3、以同源二聚體形式存在,由分子量為22.5KD的兩條多肽鏈通過不同的糖基化組成.CD69在細(xì)胞表面表達(dá)均為磷酸化形式,這對(duì)它與其它細(xì)胞表面的蛋白分子連接很重要.CD69在細(xì)胞的生物功能中起著重要的信號(hào)傳導(dǎo)作用.它可介導(dǎo)細(xì)胞的激活及激活后細(xì)胞因子的合成.更重要的是,CD69對(duì)細(xì)胞的凋亡中也有重要作用.體內(nèi)激活的具有CD69高表達(dá)的T細(xì)胞體外易于快速自發(fā)凋亡,CD69<'-/->小鼠腹腔和脾中淋巴細(xì)胞存活率增高,凋亡明顯減少,脾淋巴細(xì)胞在激活

4、后的凋亡明顯低于野生型小鼠,并有凋亡信號(hào)Caspase-3的活化減少. 研究目的： 利用IL-5高分泌轉(zhuǎn)基因小鼠外周血中有大量Eos的特點(diǎn),提純其外周血Eos,觀察在細(xì)胞刺激因子PMA+MA的作用下Eos表面CD69表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化,以及不同的細(xì)胞因子對(duì)此表達(dá)的影響;以確立CD69是否可以作為小鼠Eos活化的表面標(biāo)記分子.同時(shí),利用成熟的哮喘小鼠模型,觀察antiCD69mAb對(duì)抗原致敏激發(fā)誘導(dǎo)的小鼠氣道反應(yīng)性和炎癥的作用

5、,與DXM的作用相比較,通過BALF中細(xì)胞因子水平測定探討兩者對(duì)炎癥抑制的作用機(jī)制. 研究方法： 1.采集IL-5高分泌轉(zhuǎn)基因小鼠外周血,利用磁珠分離系統(tǒng)陰性選擇提純外周血中Eos.以PMA+MA刺激提純的Eos,檢測在1h,12h,18h,24h不同時(shí)刻Eos表面CD69的表達(dá)及細(xì)胞的存活率,設(shè)空白培養(yǎng)液培養(yǎng)的Eos為對(duì)照組.檢測不同的細(xì)胞因子 IL-4、IL-5、IFN-γ、GM-CSF、IL-12、IL-13培養(yǎng)1

6、8小時(shí)后Eos表面CD69的表達(dá)及細(xì)胞的存活率.同時(shí)觀察哮喘小鼠外周血和BALF 中Eos表面CD69的表達(dá). 2.利用成熟哮喘小鼠模型,在OVA激發(fā)后腹腔注射antiCD69mAb觀察它對(duì)哮喘的氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥的抑制作用,并與OVA激發(fā)前、后腹腔注射DXM對(duì)哮喘的抑制作用相比較,檢測小鼠BAF中IL-5、GM-CSF、CRP的水平來探討兩者對(duì)哮喘氣道病理生理變化的影響機(jī)制. 結(jié)論： 1.CD69可作為小鼠