擬南芥26S蛋白酶體亞基RPN1a的功能與生化分析.pdf

1、植物要按照一定的時序進行生長發(fā)育，需要精確并且及時合成相關(guān)功能蛋白質(zhì)，同時也需要及時將已完成使命的蛋白質(zhì)進行清除，蛋白質(zhì)的降解同樣至關(guān)重要。泛素/26S蛋白酶體通過選擇性的降解功能蛋白質(zhì)，廣泛參與激素信號轉(zhuǎn)導、細胞周期調(diào)控、脅迫應答等生長發(fā)育過程的調(diào)節(jié)，幾乎參與了生命過程中所有環(huán)節(jié)的調(diào)控。26S蛋白酶體（26S proteasome）在植物細胞中廣泛存在，是一個巨大的多亞基復合體，屬于ATP依賴的蛋白酶，由19S調(diào)節(jié)顆粒（regulat

2、ory particle，RP）和20S核心顆粒（core protease，CP）兩部分組成。19S調(diào)節(jié)顆粒需要ATP提供能量來幫助特異性識別被底物，去除底物的泛素共價鍵，進行解折疊，并且打開通道指引去折疊多肽轉(zhuǎn)移到20S核心顆粒內(nèi)進行降解。正是由于19S調(diào)節(jié)顆粒對底物識別的特異性，使得泛素/26S蛋白酶體可以精細的調(diào)控生長發(fā)育過程中的各個環(huán)節(jié)。目前大部分19S調(diào)節(jié)顆粒亞基具體功能尚不清楚，只有極少數(shù)被報道參與脅迫應答反應，且相關(guān)分子

3、機制并不十分清楚，對19S調(diào)節(jié)顆粒各亞基的功能研究對揭示相關(guān)分子機制具有重要的意義。本研究中，我們通過以RPN1a為誘餌篩選酵母擬南芥全基因組質(zhì)粒文庫，篩選到ABA（Abscisic acid）信號途徑中的關(guān)鍵基因ABI1與RPN1a相互作用，鑒定了RPN1A T-DNA插入突變體植株。通過ABA脅迫處理證明RPN1a參與負調(diào)控ABA信號途徑；在突變體鑒定過程中觀察到，RPN1A T-DNA插入突變體植株葉片表皮毛密度增大，進一步研究發(fā)

4、現(xiàn)插入突變體植株葉片和主莖上表皮毛密度增大和分支數(shù)增加。本論文對RPN1a在ABA信號途徑，以及表皮毛發(fā)育調(diào)控中的功能進行了研究，具體結(jié)果如下：
　　（1）在Tair數(shù)據(jù)庫中搜索RPN家族成員進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)RPN家族成員呈染色體定位數(shù)目不等分布，成員之間氨基酸序列相似度低，基因結(jié)構(gòu)的外顯子和內(nèi)含子數(shù)目變化不定不具有保守性，進化關(guān)系較遠。RPN1a蛋白不含信號肽序列，沒有明顯的疏水區(qū)域，沒有跨膜結(jié)構(gòu)域不是膜蛋白。與生物信息

5、學分析結(jié)果相對應，由RPN1a自身啟動子驅(qū)動表達的帶有綠色熒光蛋白質(zhì)標簽的RPN1a融合蛋白在細胞中各處表達。
　　（2）啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析發(fā)現(xiàn)RPN1a基因含有大量激素相關(guān)以及脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，說明RPN1a可能參與植物脅迫應答。以RPN1a為誘餌篩選擬南芥全基因組質(zhì)粒文庫，篩選到ABI1與RPN1a相互作用。通過酵母雙雜交以及雙分子熒光互補實驗（BiFC）證實RPN1a可與ABI1相互作用，并且通過酵母雙雜交實驗

6、發(fā)現(xiàn)RPN1a全長不能夠與PYR1,PYL1,RCAR1,ABI2,HAB1,PP2CA,SnRK2.2,SnRK2.3以及OST1發(fā)生相互作用，說明RPN1a可通過與ABI1的相互作用參與ABA信號的調(diào)控。
　?。?）RPN1a的mRNA的表達水平和蛋白質(zhì)水平均受到ABA抑制，rpn1a突變體具有ABA超敏感表型，在ABA脅迫下萌發(fā)以及根的伸長受到抑制、氣孔關(guān)閉更快，由自身啟動子驅(qū)動的RPN1a融合蛋白在保衛(wèi)細胞中的表達比周圍細

7、胞更強，且ABA信號途徑中關(guān)鍵基因的表達量升高，說明RPN1a參與ABA信號途徑的負調(diào)控。進一步研究發(fā)現(xiàn)ABI5在rpn1a突變體中積累，但是RPN1a不能與ABI5發(fā)生直接的相互作用，表明RPN1a通過與ABI1的相互作用影響ABI5蛋白質(zhì)的豐度來參與ABA信號的調(diào)控。
　　（4）外源性GA(Gibberellic acid）以及CK(Cytokinin）可以誘導擬南芥表皮毛細胞的形成，ZFP6（鋅指蛋白質(zhì)6）通過整合赤霉素和細