歐洲鰻鱺粘膜免疫球蛋白的純化及其結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、近二十年來，魚類免疫學(xué)研究逐漸成為了魚類預(yù)防醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，并且取得了很大的進(jìn)步。目前有關(guān)魚類免疫學(xué)的研究多以中樞和外周免疫系統(tǒng)為主，對粘膜免疫系統(tǒng)的研究較少。而魚類生活在富含病原的“多菌”水環(huán)境中，其大面積的粘膜包括表皮、腸和鰓的粘膜構(gòu)成了抵御病原微生物侵入的第一道防線，因此，對粘膜免疫的深入研究將有利于了解魚類病原侵入、致病和康復(fù)的規(guī)律。粘膜免疫球蛋白(mIg)在魚類粘膜免疫中發(fā)揮十分重要的作用，鑒別魚類mIg與血清免疫球蛋白(Ig

2、)在結(jié)構(gòu)和抗原性上的差異，闡明魚類mIg的發(fā)生與來源，建立魚類Ig分析與檢測方法，并用于監(jiān)測魚類的免疫狀態(tài)，評價疫苗的免疫效果，對于推動魚類免疫學(xué)的發(fā)展具有重要的學(xué)術(shù)價值。本實(shí)驗(yàn)以歐洲鰻鱺為模型，提取、純化了歐洲鰻鱺mIg和血清Ig，并對兩者的結(jié)構(gòu)和抗原性進(jìn)行了比較分析。 1.親和層析實(shí)驗(yàn) 采用飽和硫酸銨鹽析法結(jié)合單克隆抗體親和層析法提純歐洲鰻鱺mIg和血清Ig。柱層析結(jié)果表明：樣品經(jīng)Sepharose-4B柱親和層析分

3、離后出現(xiàn)一個銳形的蛋白峰，蛋白主要分布于收集物的第2-6管，蛋白峰和抗原活性峰重疊；鰻鱺血清Ig峰值管蛋白濃度為1.5046mg·mL-1，ELISA效價為1∶10240；鰻鱺mIg共收集了14管，蛋白總量約為743.6μg，峰值管ELISA效價為1∶128。 2.凝膠電泳分析在變性還原條件下，凝膠電泳結(jié)果表明：親和層析純化的mIg的蛋白條帶總數(shù)明顯少于硫酸銨沉淀的mIg。其重鏈和輕鏈的分子量分別為68kD和26kD，此外，還有

4、一個在分子量約為17kD的蛋白帶，它是共洗脫的粘液雜蛋白，還是mIg的固有成分或降解產(chǎn)物需要進(jìn)一步驗(yàn)證；親和純化的鰻鱺血清Ig，其重鏈分子量約為68kD，輕鏈有3條，分子量分別為21kD、23kD和26kD。在非變性非還原條件下，凝膠電泳結(jié)果顯示：純化的mIg只有一條蛋白帶，分子量約為350kD，略呈擴(kuò)散拖帶現(xiàn)象。這一結(jié)果提示自然條件下鰻鱺mIg可能以二聚體形式存在；血清Ig有二個蛋白帶分子量約為790kD和350kD，提示鰻鱺血清Ig

5、是以四聚體和二聚體形式存在。在變性非還原條件下，凝膠電泳結(jié)果：純化的歐鰻mIg有三條蛋白帶，分子量約為350kD、138kD和135kD，表明歐鰻mIg可能在SDS作用下解聚產(chǎn)生單體；歐鰻血清Ig有三條蛋白帶，分子量約為790kD、593kD和350kD，提示歐鰻血清Ig四聚體在SDS作用下可解聚產(chǎn)生三聚體(593kD)。 3.免疫印跡分析以兔抗親和純化的鰻鱺血清Ig多克隆抗體作為免疫印跡的探針，分析純化的鰻鱺mIg和血清Ig，