從血漿分離的組分Ⅰ+Ⅲ中純化免疫球蛋白G.pdf

1、免疫球蛋白(Ig)是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，發(fā)揮著識(shí)別中和細(xì)菌、病毒以及活化補(bǔ)體的作用。人血漿中的免疫球蛋白有5種類型，主要是卜球蛋白，即IgG。IgG最顯著的特點(diǎn)是能夠特異性地識(shí)別抗原，并與之結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物被吞噬細(xì)胞吞噬后，使抗原失去毒性和致病性。目前，臨床上主要采用靜脈注射免疫球蛋白作為免疫疾病的治療藥物，且用藥適應(yīng)征和藥品用量都在不斷地增加，由于原料血漿限制，目前免疫球蛋白的生產(chǎn)企業(yè)和產(chǎn)量有限，不能滿足臨床的需求，因此

2、尋找免疫球蛋白增產(chǎn)的途徑具有重大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。
　　血液制品是由健康的人血漿或經(jīng)特異免疫的人血漿經(jīng)分離、提純或運(yùn)用重組DNA技術(shù)制得的血漿蛋白的組分，以及血液細(xì)胞的有形成分的統(tǒng)稱。按照結(jié)構(gòu)和功能方面的不同，血液制品分為三大類，分別為白蛋白、免疫球蛋白和人凝血因子。其中，免疫球蛋白制品根據(jù)使用方式的不同分為肌注型和靜注型，另外還有由特異免疫血漿制備的特異性免疫球蛋白。從人血漿中分離純化的血液制品具有純度相對(duì)高、安全性好、生物活性

3、強(qiáng)和穩(wěn)定性較高的優(yōu)點(diǎn)。
　　目前國內(nèi)外獲取免疫球蛋白主要是從血漿或相關(guān)組分Ⅱ+Ⅲ或相關(guān)組分Ⅰ+Ⅱ中純化制備，鮮有從Ⅰ+Ⅲ中提取制備的，主要是因?yàn)榻M分Ⅰ+Ⅲ組成復(fù)雜，分離提純難度大，不易分析。但經(jīng)過試驗(yàn)和參考文獻(xiàn)證實(shí)，組分Ⅰ+Ⅲ中確實(shí)含有一定量的IgG，大有可回收的價(jià)值。目前，國內(nèi)主要有低溫乙醇法、離子交換層析法、辛酸鹽沉淀非IgG類蛋白等方法從組分Ⅰ+Ⅲ中分離IgG。本課題擬研究建立從血漿分離的組分Ⅰ+Ⅲ中純化免疫球蛋白G的規(guī)模化

4、制備工藝。
　　經(jīng)過工藝研究，確定采用去除雜蛋白的辛酸沉淀法進(jìn)行層析前處理，再用陰離子交換層析技術(shù)吸附雜蛋白，獲得高純度的IgG原液。本試驗(yàn)用辛酸沉淀的方法提取IgG，既提高了收率，又對(duì)脂蛋白有較好的沉降效果，能夠延長凝膠的壽命。同時(shí)，辛酸具有滅活脂包膜病毒的作用，降低了病毒傳播的風(fēng)險(xiǎn)。通過緩沖液濃度、pH、溫度、正辛酸的用量、固液比例五個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定了IgG純度和收率最佳的組合條件，即:醋酸-醋酸鈉緩沖液濃度是20mm

5、ol/L;固液比例是3倍;溶解液的pH值是4.5;溶解的溫度是7℃;加入辛酸的量是16ml/L，選用GE公司提供的Macro CapQ作為陰離子交換介質(zhì)，將層析前樣品pH調(diào)整到5.8±0.05，電導(dǎo)率值調(diào)整到1.5±0.05mS/cm，可達(dá)到純化的目的。
　　通過納米膜過濾達(dá)到去除病毒的目的。試驗(yàn)分析了蛋白質(zhì)濃度、pH、電導(dǎo)率、保護(hù)劑濃度對(duì)納米膜的影響。經(jīng)過多重比較，發(fā)現(xiàn)保護(hù)劑對(duì)過濾效果影響不大，確定了納米膜過濾最優(yōu)組合為蛋白質(zhì)濃

6、度為4mg/ml、pH值為6.0、電導(dǎo)率為5.3mS/cm。
　　根據(jù)樣品檢測結(jié)果可以看出，該工藝生產(chǎn)的靜注人免疫球蛋白產(chǎn)品多項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于2010版《中國藥典》的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，IgG純度明顯高于《中國藥典》和《歐洲藥典》的要求，IgG單體+二聚體≥99.0％，高于《中國藥典》95％的規(guī)定。與市售靜注人免疫球蛋白產(chǎn)品的質(zhì)量對(duì)比，本工藝生產(chǎn)的靜注人免疫球蛋白產(chǎn)品各項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)均不低于同類市售產(chǎn)品水平。
　　本研究取得的成果和結(jié)論:

7、r>　　(1)通過測定血漿分離組分廢棄物中IgG，發(fā)現(xiàn)低溫乙醇沉淀組分Ⅰ+Ⅲ一步就損失約16％的IgG，有必要以組分Ⅰ+Ⅲ為原料回收IgG;
　　(2)通過對(duì)從Cohn氏組分Ⅰ+Ⅲ中回收IgG層析前處理工藝的優(yōu)化，確定使用辛酸沉淀法、再用陰離子交換層析法可獲得高純度的IgG原液;
　　(3)建立了人免疫球蛋白Macro CapQ層析工藝，篩選確定了提高人免疫球蛋白單體+二聚體純度和收率的最佳層析條件;
　　(4)優(yōu)化了