發(fā)酵重組大腸桿菌產(chǎn)（+）γ-內(nèi)酰胺酶及酶的固定化研究.pdf

1、(-)γ-內(nèi)酰胺是一種重要的化學中間體，主要可以用來制備阿巴卡韋和帕拉米韋等藥物。
　　本文主要研究內(nèi)容為重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)(+)γ-內(nèi)酰胺酶的條件優(yōu)化以及(+)γ-內(nèi)酰胺酶的固定化方法研究。
　　我們在15L發(fā)酵罐中通過對不同培養(yǎng)條件的實驗比較，最終成功探索出一種適合于重組大腸桿菌生長產(chǎn)(+)γ-內(nèi)酰胺酶的方法——雙程培養(yǎng)雙程誘導法，即在37℃下培養(yǎng)菌種至對數(shù)生長期開始時升溫至42℃培養(yǎng)至放罐，在對數(shù)期結(jié)束后加入乳糖進行

2、誘導約6h后加入等量乳糖再誘導一次，經(jīng)過重復實驗反復比較發(fā)現(xiàn)此法發(fā)酵所得(+)γ-內(nèi)酰胺酶酶量最大。全細胞轉(zhuǎn)化實驗表明:0.16g濕菌體在50℃下反應1h催化2ml，5g/L的（±）γ-內(nèi)酰胺ee值可達95％以上，此結(jié)果可以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。
　　以離子交換樹脂和氨基樹脂（HA樹脂）為固定化載體對酶的固定化進行了研究，結(jié)果表明:離子交換樹脂在200g/L的高濃度底物反應下酶容易脫落，固定化酶重復使用次數(shù)較少且產(chǎn)物收率較低;HA樹

3、脂則呈現(xiàn)出較好的固定化效果，其酶活可達1200 U/g。對HA樹脂為載體的固定化條件進行了研究，優(yōu)化后的最佳條件為:交聯(lián)溫度30℃，戊二醛濃度4％，交聯(lián)時間為2h，在此交聯(lián)條件下樹脂完成固定化反應后載酶量達到最大;最佳固定化條件為在30℃下固定化6h樹脂載酶量可達最大。固定化后酶的Km值從3.93g/L升高到14.54g/L，Vmax從0.89g/L*min下降到0.63g/L*min;最適溫度保持不變均為80℃，固定化后耐熱性有所下降

4、;最適pH保持不變均為8.0，固定化后pH耐受性大幅增強，在4-10的pH范圍酶活幾乎不受影響;進一步研究發(fā)現(xiàn)固定化后酶的表觀活化能從40.03kJ/mol降低到33.61 kJ/mol，實驗說明固定化酶的反應不是受酶動力學的影響而是受到傳質(zhì)影響。重復實驗顯示50次反應后仍然有50％的酶活剩余，該結(jié)果可以滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求。
　　本文還研究了新型固定化酶載體的制備及其運用。通過環(huán)氧氯丙烷與氧化石墨烯反應，對氧化石墨烯的羧基進行環(huán)氧