發(fā)酵重組大腸桿菌產(chǎn)（+）γ-內(nèi)酰胺酶及酶的固定化研究.pdf

1、(-)γ-內(nèi)酰胺是一種重要的化學(xué)中間體，主要可以用來(lái)制備阿巴卡韋和帕拉米韋等藥物。
　　本文主要研究?jī)?nèi)容為重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)(+)γ-內(nèi)酰胺酶的條件優(yōu)化以及(+)γ-內(nèi)酰胺酶的固定化方法研究。
　　我們?cè)?5L發(fā)酵罐中通過對(duì)不同培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)比較，最終成功探索出一種適合于重組大腸桿菌生長(zhǎng)產(chǎn)(+)γ-內(nèi)酰胺酶的方法——雙程培養(yǎng)雙程誘導(dǎo)法，即在37℃下培養(yǎng)菌種至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開始時(shí)升溫至42℃培養(yǎng)至放罐，在對(duì)數(shù)期結(jié)束后加入乳糖進(jìn)行

2、誘導(dǎo)約6h后加入等量乳糖再誘導(dǎo)一次，經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)反復(fù)比較發(fā)現(xiàn)此法發(fā)酵所得(+)γ-內(nèi)酰胺酶酶量最大。全細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明:0.16g濕菌體在50℃下反應(yīng)1h催化2ml，5g/L的（±）γ-內(nèi)酰胺ee值可達(dá)95％以上，此結(jié)果可以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。
　　以離子交換樹脂和氨基樹脂（HA樹脂）為固定化載體對(duì)酶的固定化進(jìn)行了研究，結(jié)果表明:離子交換樹脂在200g/L的高濃度底物反應(yīng)下酶容易脫落，固定化酶重復(fù)使用次數(shù)較少且產(chǎn)物收率較低;HA樹

3、脂則呈現(xiàn)出較好的固定化效果，其酶活可達(dá)1200 U/g。對(duì)HA樹脂為載體的固定化條件進(jìn)行了研究，優(yōu)化后的最佳條件為:交聯(lián)溫度30℃，戊二醛濃度4％，交聯(lián)時(shí)間為2h，在此交聯(lián)條件下樹脂完成固定化反應(yīng)后載酶量達(dá)到最大;最佳固定化條件為在30℃下固定化6h樹脂載酶量可達(dá)最大。固定化后酶的Km值從3.93g/L升高到14.54g/L，Vmax從0.89g/L*min下降到0.63g/L*min;最適溫度保持不變均為80℃，固定化后耐熱性有所下降

4、;最適pH保持不變均為8.0，固定化后pH耐受性大幅增強(qiáng)，在4-10的pH范圍酶活幾乎不受影響;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)固定化后酶的表觀活化能從40.03kJ/mol降低到33.61 kJ/mol，實(shí)驗(yàn)說(shuō)明固定化酶的反應(yīng)不是受酶動(dòng)力學(xué)的影響而是受到傳質(zhì)影響。重復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示50次反應(yīng)后仍然有50％的酶活剩余，該結(jié)果可以滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求。
　　本文還研究了新型固定化酶載體的制備及其運(yùn)用。通過環(huán)氧氯丙烷與氧化石墨烯反應(yīng)，對(duì)氧化石墨烯的羧基進(jìn)行環(huán)氧