微膠囊固定化重組大腸桿菌萃取發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸的研究.pdf

1、作為人體八種必需氨基酸之一的L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine，L-Phe)，是一種重要的合成中間體，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，可作為食品添加劑、抗癌藥物中間體和合成阿斯巴甜的原料，具有非常廣闊的市場前景。 利用固定化重組大腸桿菌細胞發(fā)酵生產(chǎn)L-Phe，是當前制備L-Phe應(yīng)用最廣泛的一種方法。本文利用兩種新型微膠囊——SA-CMC/CaCl2微膠囊體系與NaCS-PDMDAAC微膠囊體系對重組大腸桿菌進行固定化，

2、探索了它們在萃取發(fā)酵生產(chǎn)L-Phe過程中的特性，并與游離細胞培養(yǎng)作了比較，試圖對實驗室探索L-Phe的工藝以及大規(guī)模生產(chǎn)L-Phe提供理論依據(jù)。 論文先對有機溶液萃取分離L-Phe作了比較系統(tǒng)的研究：以磷酸二(2-乙基己基)脂(D2EHPA)為萃取劑，環(huán)己烷為稀釋劑萃取L-Phe，研究了L-Phe濃度、D2EHPA濃度、溫度對萃取分配系數(shù)D的影響，以及負載L-Phe有機相的反萃取特性。結(jié)果表明：萃取分配系數(shù)D隨溫度的升高而降低，

3、而L-Phe濃度對分配系數(shù)的影響還與水相初始pH值有關(guān)；萃合物是以一個L-Phe分子和二個D2EHPA分子結(jié)合而成。在利用酸溶液對負載L-Phe有機相的反萃取過程中，反萃取的效果符合HCI>HNO3≥H2SO4>CH3COOH，且隨HCl濃度和溫度的升高而升高。 然后研究了游離重組大腸桿菌細胞生長特性，結(jié)果表明：在游離培養(yǎng)的情況下，培養(yǎng)12 h時即可達穩(wěn)定期，葡萄糖也在這一時間段內(nèi)被迅速消耗，到14 h時葡萄糖已消耗完全，而L-

4、Phe的產(chǎn)量在對數(shù)期(10 h左右)達到峰值，但此后出現(xiàn)一定的下降，這可能是在游離培養(yǎng)達穩(wěn)定期時被細胞消耗所致。萃取劑對重組大腸桿菌具有毒害作用，所以在后續(xù)的研究過程中，必須避免使菌體細胞直接與萃取劑進行接觸。而兩種新型固定化體系——SA-CMC/CaCl2微膠囊體系和NaCS-PDMDAAC微膠囊體系具有良好的生物相容性，可用于重組大腸桿菌的發(fā)酵生產(chǎn)過程。 接下來研究了SA-CMC/CaCl2微膠囊固定化重組大腸桿菌萃取發(fā)酵生

5、產(chǎn)L-Phe，先是確定了有利發(fā)酵過程的微膠囊制備濃度：12～14 g L-1的CMC，8～10 g L-1的SA，12～14 g L-1的CMC，80～100 g L-1的CaCl2。然后考察了不同制備濃度制備的微膠囊的機械性能，結(jié)果表明SA-CMC/CaCl2微膠囊在萃取劑存在的情況下穩(wěn)定性非常差，其中以12.0 g L-1 CMC、10.0 g L-1SA、100.0 g L-1CaCl2制備得到微膠囊的穩(wěn)定性相對較好。最后考察以1

6、2.0 g L-1CMC、10.0 g L-1SA、100.0g L-1CaCl2制備得到的微膠囊固定化重組大腸桿菌萃取發(fā)酵生產(chǎn)L-Phe的情況，結(jié)果表明：由于受傳質(zhì)的影響，SA-CMC/CaCl2微膠囊固定化培養(yǎng)的延遲期延長了2 h左右，但最終的菌體濃度略為升高；另外在生長末期，微膠囊固定化情況下的L-Phe沒有明顯的消耗；同時，在0 h時加入萃取劑的微膠囊固定化萃取發(fā)酵過程的產(chǎn)量約為1.70 g L-1L-Phc；14 h的產(chǎn)量約為

7、10.40 g L-1L-Phc。 最后考察了NaCS-PDMDAAC微膠囊固定化重組大腸桿菌萃取發(fā)酵生產(chǎn)I-Phe，先確定了有利發(fā)酵過程的微膠囊制備濃度：3％～4％的NaCS，4％～5％的PDMDAA.然后考察了不同制備濃度下制備的微膠囊的機械性能，結(jié)果表明NaCS-PDMDAAC微膠囊具備非常良好穩(wěn)定性，并不受萃取劑的影響。綜合考慮傳質(zhì)因素，認為以3％的NaCS，4％的PDMDAAC制備得到微膠囊用于固定化重組大腸桿菌培養(yǎng)更

8、好。研究以3％的NaCS，4％的PDMDAAC制備得到的微膠囊固定化重組大腸桿菌萃取發(fā)酵生產(chǎn)L-Phc，結(jié)果表明：由于NaCS-PDMDAAC微膠囊囊膜非常致密，受傳質(zhì)影響，NaCS-PDMDAAC微膠囊固定化培養(yǎng)的延遲期比游離培養(yǎng)延長了4 h左右，比SA-CMC/CaCl2微膠囊固定化培養(yǎng)延長了2 h左右，而且最終的菌體濃度相對偏低、葡萄糖并未完全消耗，最終的殘?zhí)菨舛燃s為4 g L-1左右；另外，在生長末期，L-Phe不存在消耗過程；