重組巨大芽孢桿菌產(chǎn)PGA的發(fā)酵過程調(diào)控及其酶的固定化.pdf

1、青霉素G酰化酶是重要的醫(yī)藥工業(yè)用酶，廣泛用于催化裂解青霉素G和頭孢霉素G生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸和7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷。青霉素G?；高€能夠催化逆反應(yīng)，即在酸性條件下催化D-氨基酸類似物與β-內(nèi)酰胺母核縮合產(chǎn)生新的β-內(nèi)酰胺抗生素。傳統(tǒng)的利用化學(xué)方法生產(chǎn)6-APA反應(yīng)步驟多、收率低、反應(yīng)條件要求高、成本高，且要用吡啶、PCl5、NOCl等高毒性試劑，易造成環(huán)境污染。相比之下，酶法合成具有絕對(duì)專一性、避免造成環(huán)境污染、反應(yīng)條件溫和等

2、優(yōu)點(diǎn)，并且生產(chǎn)成本至少可以降低10％。若酶法合成6-APA與發(fā)酵生產(chǎn)青霉素結(jié)合，整個(gè)生產(chǎn)過程就更經(jīng)濟(jì)。因此通過微生物發(fā)酵法產(chǎn)胞外青霉素G?；福岣咂渖a(chǎn)水平，獲得完整的發(fā)酵工藝具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 本文以通過基因工程技術(shù)手段改造的巨大芽孢桿菌為試驗(yàn)菌種，對(duì)其發(fā)酵條件優(yōu)化、分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、青霉素G?；傅姆蛛x純化、青霉素G?；傅墓潭ɑ捌涿笇W(xué)性質(zhì)等進(jìn)行研究，主要結(jié)果如下：
　　 將單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法相結(jié)合，

3、對(duì)重組巨大芽孢桿菌產(chǎn)青霉素G?；傅膿u瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。單因素試驗(yàn)確定最適碳源、氮源以及碳源濃度、氮源濃度、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度的范圍分別為25-35 g/L、10-20g/L、36-44 h和29-37℃。采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析方法，對(duì)重組巨大芽孢桿菌產(chǎn)青霉素G?；傅陌l(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得出其最佳發(fā)酵條件為：葡萄糖32g/L、酪蛋白17g/L、時(shí)間42.5h、溫度34℃，在此條件下青霉素G?；傅幕盍_(dá)到33

4、514.28 U/L，較優(yōu)化前提高了8.66％。
　　 利用5L發(fā)酵罐對(duì)重組巨大芽孢桿菌產(chǎn)青霉素G?；傅陌l(fā)酵過程進(jìn)行了放大，在優(yōu)化條件下發(fā)酵液青霉素G?；富盍蛇_(dá)到39887 U/L。以該菌株在5L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵的數(shù)據(jù)為依據(jù)，在Matlab平臺(tái)下，利用遺傳算法建立了分批發(fā)酵生產(chǎn)青霉素G酰化酶的菌體生長(zhǎng)、青霉素G?；负铣梢约盎|(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型，分別如下：
　　 (1)菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型X=0.20477e0.425

5、32t/7.14863+0.02877e0.42532t
　　 (2)青霉素G酰化酶合成動(dòng)力學(xué)模型P=0.49714e0.42532t/7.14863+0.02877e0.42532t+1.4587×ln7.14863+0.02877e0.42532t/7.1774
　　 (3)基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型S=33.47919-0.60164e0.42532t/7.14863+0.02877e0.42532t-0.68496×ln

6、7.14863+0.02877e0.42532t/7.1774
　　 所建模型能夠較好描述重組巨大芽孢桿菌分批發(fā)酵產(chǎn)青霉素G?；傅膭?dòng)態(tài)過程，可以為以后的進(jìn)一步放大試驗(yàn)提供參考。
　　 對(duì)青霉素G?；傅姆蛛x純化工藝進(jìn)行了研究，依次采用超濾、硫酸銨鹽析和濃縮除鹽操作對(duì)青霉素G?；高M(jìn)行逐級(jí)純化。結(jié)果顯示純化后的青霉素G?；副然盍_(dá)到29.16 U/mg，純化倍數(shù)為1.59倍，活力回收率為60.59％。
　　 探

7、討了環(huán)氧基樹脂固定化青霉素G酰化酶的工藝條件。運(yùn)用單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合對(duì)影響環(huán)氧基樹脂固定化青霉素G?；傅闹饕蛩剡M(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示最佳固定化條件為：pH8.1、溫度29℃、載體用量1 g、時(shí)間24 h，在此條件下固定化酶活力達(dá)到363.76 U/g，酶活回收率為62.82％。對(duì)最佳條件下制備的固定化青霉素G?；傅奶匦赃M(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該固定化酶的最適反應(yīng)pH值為9.0，最適反應(yīng)溫度為60℃，具有良好的連續(xù)操作