解淀粉芽孢桿菌SQR9吲哚乙酸合成途徑及促生效應(yīng)的研究.pdf

1、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliqueficiens)SQR9是本實驗室從黃瓜根際分離的一株促生菌株，對黃瓜?；筒≡怄哏牭毒泻軓姷霓卓构δ堋Ｔ谂柙院痛筇镌囼炛?，該菌株表現(xiàn)出良好的促生和土傳病害防控效果，其與腐熟堆肥制成的微生物有機肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已得到廣泛應(yīng)用。
　　本文通過盆栽實驗驗證了解淀粉芽孢桿菌SQR9對植株生長的促進(jìn)作用，檢測了SQR9產(chǎn)生的各種促生因子，通過轉(zhuǎn)錄水平分析、基因敲除、基因融合表達(dá)和隨

2、機突變建庫的方法探索了SQR9吲哚乙酸(IAA)合成的機制，并研究了IAA對SQR9促生能力的影響，獲得了以下研究結(jié)果:
　　1.在黃瓜及玉米盆缽實驗中，解淀粉芽孢桿菌SQR9能顯著促進(jìn)兩種植物的生長。1×109 CFU SQR9活體菌處理(T2)比5×108 CFU活體菌的處理(T1)促生效果更好，而兩個滅活菌體的處理無顯著差異。與對照相比，T1和T2處理的地上部分干重、黃瓜株高、根長和根表面比例分別升高60.1％、45.7％、

3、29.3％和30.7％以及90.0％、71.6％、56.3％和65.6％。在玉米處理中，T1處理的玉米株高、地上部分干重、根長和根表面積升高比例分別為36.2％、30.6％、32.1％和20.0％以及T2處理相對應(yīng)的指標(biāo)升高65.3％、47.8％、42.6％和52.0％。
　　2.以哥倫比亞型擬南芥為材料與SQR9和大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α共培養(yǎng)16d后，對其長勢進(jìn)行觀察。與PBS對照和E.coli D

4、H5α處理相比，SQR9處理的擬南芥生長旺盛，根長和葉片大小均高于前兩者，以此可以初步推斷，SQR9可以產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)(VOC)促進(jìn)擬南芥的生長。
　　3.通過化學(xué)分析的方法表明，SQR9在實驗室條件下可產(chǎn)生植酸酶、2，3-丁二醇、乙偶姻、IAA和赤霉素(GA3)，且在培養(yǎng)基中加入色氨酸后IAA產(chǎn)量明顯升高。
　　4.根據(jù)植物和微生物中已報道的IAA合成途徑，通過預(yù)測SQR9基因組(NCBI登錄號: CP006890)中基因

5、的蛋白功能域，篩選出SQR9中14個可能與IAA合成相關(guān)的候選基因。為檢測篩選出的基因是否參加色氨酸依賴型IAA合成途徑，我們對加入色氨酸培養(yǎng)的細(xì)胞中這些基因表達(dá)情況進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，包括:patB，編碼一個可能的轉(zhuǎn)氨酶，上調(diào)3.5倍;yhcX,預(yù)測的腈水解酶，上調(diào)3倍;dhaS，編碼一個可能的吲哚乙醛脫氫酶，上調(diào)了2.5倍;ysnE，預(yù)測為IAA乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，上調(diào)了2倍;yclB，預(yù)測蛋白為芳香酸脫

6、羧酶，上調(diào)了1.5倍;yclC基因和yclB基因位于同一個基因簇，編碼芳香酸脫羧酶，上調(diào)了2倍。我們推測這六個基因可能參與SQR9中IAA合成的IPyA途徑、TAM途徑、IAN途徑和一個未確認(rèn)的合成途徑。
　　5.采用雙交換重組的方法對篩選出的六個基因進(jìn)行敲除。發(fā)現(xiàn)突變菌株△ysnE、△dhaS、△yclC和△yhcX IAA產(chǎn)量分別為野生型SQR9菌株的14％、23％、45％和76％，而突變體△patB和△yclB IAA產(chǎn)量和

7、SQR9相比沒有明顯變化。采用大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pUBC-19對突變體△ysnE、△dhaS、△yclC和△yhcX進(jìn)行互補實驗，結(jié)果表明各突變體的互補菌株IAA合成恢復(fù)到和SQR9相當(dāng)?shù)乃?。由結(jié)果可知，ysnE編碼的色氨酸酰基轉(zhuǎn)移酶可能參與SQR9中IAA合成的主要途徑，IPyA和TAM途徑也頗為重要，而IAN途徑對SQR9中IAA的合成貢獻(xiàn)較小。
　　6.根據(jù)上述反轉(zhuǎn)錄定量PCR及突變子分析的結(jié)果，我們挑選出三個

8、可能組成IPyA途徑的基因(patB、yclC和dhaS)并通過同源和異源表達(dá)加以驗證。通過融合PCR將這三個基因連接起來，再插入到構(gòu)建好的pUBC19-P43質(zhì)粒中，使其在P43啟動子的調(diào)控下表達(dá)。為測定同源與異源表達(dá)菌株產(chǎn)IAA的能力，使用舍空載pUBC19-P43質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌168和SQR9作為對照。SQR9過表達(dá)菌株(SQR9-E)IAA的產(chǎn)量是SQR9-CK的4倍，約為42 mg l-1，枯草芽孢桿菌過表達(dá)菌株(168-

9、E)與對照相比IAA產(chǎn)量升高10倍，約為22 mg l-1。
　　7.利用mariner轉(zhuǎn)座元件Himar1轉(zhuǎn)座誘變體系構(gòu)建解淀粉芽孢桿菌SQR9菌株的突變體文庫。在3000個轉(zhuǎn)化子中篩選得到三株IAA產(chǎn)量穩(wěn)定變化的突變株，在SQR9-IAA1突變株的發(fā)酵液中檢測到IAA含量很低，SQR9-IAA2突變株發(fā)酵液中的IAA為野生型SQR9的50％，而SQR9-IAA3突變株的IAA產(chǎn)量明顯升高，約為野生型SQR9的2.4倍。通過轉(zhuǎn)座

10、子插入位點分析可知，在SQR9-IAA1菌株中，轉(zhuǎn)座子插入位點為qox基因簇的qoxB基因;在SQR9-IAA2菌株中，轉(zhuǎn)座子插入到y(tǒng)lmD基因;突變體SQR9-IAA3插入位點為yngF。這三個基因在SQR9中參與IAA合成的機理還需要進(jìn)一步的研究。
　　8.為研究IAA產(chǎn)量變化對SQR9促生效果的影響，我們采用IAA合成變化的突變菌株研究其對黃瓜和玉米生長及對黃瓜根系發(fā)育的影響。野生型SQR9在菌液濃度為107 CFU ml-

11、1時，對黃瓜根的伸長具有最顯著的促進(jìn)效果，菌液濃度在l08 CFUml-1時，對黃瓜初生根的伸長具有抑制效果，卻刺激次生根的形成。在菌液濃度為107CFU ml-1時，與對照相比，SQR9處理的根長增長了137％，根表面積增長了88％。IAA產(chǎn)量下降的菌株△ysnE對黃瓜的根長和根表面積均沒有顯著促進(jìn)效果。IAA產(chǎn)量升高的過表達(dá)菌株SQR9-E處理過的黃瓜與對照相比根長增長了58％,但與SQR9處理相比降低了32％，與對照相比根表面積增

12、長了166％，與SQR9處理的黃瓜相比根表面積僅下降了15％。盆栽實驗中，與對照相比，各處理均表現(xiàn)出對黃瓜和玉米生長的促進(jìn)作用。突變菌株SQR9-IAA1對黃瓜和玉米的促生能力與野生型SQR9相比略有降低，其中黃瓜植株的生物量和株高降低了約24％和19％，玉米植株的生物量和株高降低了約21％和17％。與SQR9處理相比，△ysnE處理黃瓜兩個指標(biāo)分別下降了23％和15％，玉米的兩個指標(biāo)分別下降15％和16％。IAA產(chǎn)量下降50％的菌株S