乙肝病毒標(biāo)準(zhǔn)序列的建立及突變位點(diǎn)與乙肝相關(guān)肝病的關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染是肝細(xì)胞癌（HCC）的主要危險(xiǎn)因素。流行病學(xué)研究也提供了大量的數(shù)據(jù)證明HBV感染與HCC有因果關(guān)聯(lián)。自從PCR技術(shù)擴(kuò)增病毒DNA面世后，對HBV基因組序列異質(zhì)性及其在發(fā)病機(jī)制和病毒蛋白表達(dá)作用的調(diào)查研究，已經(jīng)成為嗜肝病毒研究的重點(diǎn)。HBV基因在慢性感染或進(jìn)行性肝病發(fā)展過程中進(jìn)行突變選擇，其中最重要的免疫逃逸突變有S區(qū)的“a”抗原決定簇突變、C區(qū)的CTL識別位點(diǎn)突變及前C區(qū)的終止密碼突變等，而其他區(qū)域研究尚少

2、。我國是HBV高流行區(qū)，其流行株與歐、美和日本等低流行區(qū)有區(qū)別，主要基因型為B型和C型。現(xiàn)存HBV標(biāo)準(zhǔn)序列多是用國外流行株全序列。建立我國HBV流行株的基因庫和標(biāo)準(zhǔn)序列，是HBV變異研究的基礎(chǔ)工作。HBV基因位點(diǎn)的變異與HBV相關(guān)疾病的關(guān)聯(lián)分析可提示一些基因位點(diǎn)的變異可能與臨床及乙肝相關(guān)疾病有關(guān)。
　　 目的：對乙肝病毒e抗原（HBeAg）陽性無癥狀表面抗原（HBsAg）攜帶者（ASCs)B2和C2基因亞型全基因序列測定，初步建

3、立以中國流行株序列為基礎(chǔ)的B2、C2基因型的HBV標(biāo)準(zhǔn)序列。同時(shí)對B、C型慢性乙型肝炎(CHB)，肝硬化(LC)和肝癌(HCC）患者的HBV部分基因序列測定，探討不同基因型（主要是C基因型）及基因變異與乙肝相關(guān)肝病不同疾病狀態(tài)的關(guān)聯(lián)。
　　 方法：利用普通及巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Nest-PCR）方法，分別擴(kuò)增485例HBeAg陽性B2和C2型ASCs全基因序列以及81例CHB，98例LC患者和135例乙肝陽性HCC患者的HBV部

4、分基因序列并測序。所有的基因序列片段先用MEGA5.0clustAlw軟件進(jìn)行序列比對然后對每段進(jìn)行拼接，將ASCs拼接成全長。以每個(gè)堿基頻率最高點(diǎn)作為"野生型"，獲得B2和C2的標(biāo)準(zhǔn)序列。在所有的樣本中只要每一類疾病B或C型中每個(gè)點(diǎn)突變頻率大于10％即作為研究“熱點(diǎn)”。數(shù)據(jù)錄入與分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件及簡明統(tǒng)計(jì)軟件10.35，應(yīng)用單因素χ2 檢驗(yàn)和非條件Logistic 回歸模型分析基因型、變異位點(diǎn)及其交互作用與ASC、C

5、HB、LC及HCC 之間的關(guān)系。圖像處理軟件ORIGIN6.0分析不同疾病狀態(tài)的不同年齡段的HBV突變頻率變化。
　　 結(jié)果：1. 獲得了HBeAg陽性的ASCs的乙肝病毒B2和C2基因亞型標(biāo)準(zhǔn)序列,兩基因型同源性為91.8％。在所有的樣本中，與ASCs比較，CHB、LC和HCC患者的年齡普遍高，男性多且C基因型居多(ASCs C基因型比例55.1％，CHB、LC和HCC C基因型比例分別為79.0％，80.6％和86.7％)。

6、
　　 2.根據(jù)HBV基因型B2和C2的“野生序列”，分析了相關(guān)區(qū)域66個(gè)熱點(diǎn)變異，大部分位點(diǎn)的突變頻率C型高于B型。C基因型中，以ASC作為對照組，A1206C是LC的危險(xiǎn)因素；C873T、G1229A、A1314G、T1344C、T1353C、A1359G、C1362T、T1497C、C1504T、T1508A、G1512A、A1727T、A2574G是HCC的危險(xiǎn)因素；C1338T、G1386A、T1464C、T1500C

7、、T1544A、G1613A、C1653T、T1674C、G1719T、A1727G、G2699C是LC、HCC的危險(xiǎn)因素；G915A、A993G、A1053G、C1218T、A1221T、G1230C、T2441C、G2699A是CHB、LC、HCC的危險(xiǎn)因素。C基因型中，以ASC作為對照組，T929A是CHB的保護(hù)因素；A1329C是LC的保護(hù)因素；T1078G、A1329C、C1505T、A1574T是HCC的保護(hù)因素；T796G

8、、A934C、T2465A是CHB、LC的保護(hù)因素；T1488C、C1491C是LC、HCC的保護(hù)因素；G834A、G912A、C2456T、A2558G是CHB、LC、HCC的保護(hù)因素。與CHB比較，A1206C是LC的危險(xiǎn)因素；與LC比較，T796G、G1229A、T1344C、A1359G、T2441C、A2574G是HCC危險(xiǎn)因素。與LC比較，G1230C是HCC保護(hù)因素。
　　 3.C基因型中，與LC比較，在HBeAg

9、陽性患者T796G、G1229A是HCC的危險(xiǎn)因素,G1230C是HCC保護(hù)型因素，說明HBeAg陽性比陰性LC患者發(fā)生T796G、G1229A更容易得HCC，而發(fā)生G1230C不易得HCC；與LC比較，在HBeAg陰性患者A2574G是HCC的危險(xiǎn)因素,說明HBeAg陰性比陽性LC患者發(fā)生A2574G更容易得HCC；與CHB比較，在HBeAg陽性患者A1206C是LC的危險(xiǎn)因素,說明HBeAg陽性比陰性CHB患者發(fā)生A1206C更容易

10、得HCC。
　　 4.單因素及多因素回歸分析表明，T796G、C1218T、A1221T、G1229A、T1344C、A2574G是HCC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；G912A、G1230C、C2456T是HCC的保護(hù)因素。在HCC和LC中，這8個(gè)位點(diǎn)并沒有隨著年齡增加突變頻率增加；ASCs中，突變頻率也沒有隨著年齡增加而變化。在T796G,G912A和C2456T中，ASC的平均突變頻率明顯高于HCC、LC和CHB組。而在C1218T,

11、A1221T和G1230C中，ASC的平均突變頻率明顯低于HCC、LC和CHB組。G1229A和A2574G中，HCC平均突變頻率（49.6％，38.5％)明顯高于LC,CHB和ASC組(G1229A分別為32.9％，28.1％，38.6％,A2574G分別為15.2％，15.6％，21.7％）。
　　 5.分析了HCC患者的拉米夫定（LAM）耐藥位點(diǎn)YMDD (M204V/I)變異情況。實(shí)驗(yàn)所用樣本均是沒有接受抗病毒治療的患者

12、，我們檢測了部分HCC樣本的P(polymerase)基因區(qū)739（YVDD）和741（YIDD）位點(diǎn)的變異情況，發(fā)現(xiàn)A739G變異僅為5.81％，G741T變異僅為4.65％，而拉米夫定治療5年耐藥率接近70％，說明未服用抗病毒藥物的自然突變率并不高。
　　 結(jié)論：1、乙肝病毒B2和C2基因亞型標(biāo)準(zhǔn)序列的異質(zhì)性為8.2％。
　　 2、C基因型中，HBeAg陽性比陰性LC患者發(fā)生T796G、G1229A更容易得HCC，而