高敏乙肝病毒檢測臨床意義

1、高敏HBV檢測臨床意義及產(chǎn)品考評工作匯報,珀金埃爾默醫(yī)學診斷孫祥杰 電話：15202126516,Our mission 愿景...,...for a healthier today and an even better tomorrow,,,,,,,Dedicated to improving the health and safety of people and the e

2、nvironment致力于改善人類的健康和促進我們生活環(huán)境的安全,國際治療路線,HBV優(yōu)化治療路線圖策略,* 由美國坦福大學醫(yī)學中心Keeffe教授（專家組）提供,各指南推薦的治療終點,美肝會指南,2008年美國肝病協(xié)會CHB防治指南：持久消除HBV是乙肝的治療終點，HBV DNA病毒載量盡可能小于或等于10 IU/ ml。,歐洲肝病研究學會EASL2010年指南指出：將HBV DNA病毒載量盡可能控制在10-15 IU/ ml

3、，能有效防止疾病的復發(fā)。,歐肝會指南,乙型肝炎病毒定量檢測試劑注冊申報技術指導原則,《乙型肝炎病毒（HBV）DNA定量檢測試劑注冊申報技術指導原則》,行業(yè)標準,專家意見,莊輝、魯鳳民等，《慢性乙型肝炎病毒DNA定量檢測的臨床意義》2012年,臨床一線對超靈敏檢測試劑需求旺盛,,傳統(tǒng)定量產(chǎn)品滿足不了臨床需求,臨床用核酸提取試劑,乙肝定量kit48測試/盒國食藥監(jiān)械（準）字2013第3402077號2013年11月,丙肝定量kit2

4、4測試/盒國食藥監(jiān)械（準）字2011第3400554號2011年5月,核酸提取kit32測試/盒滬青械備20140045號2014年12月,,,,,,高靈敏：HBV 檢測下限：20 IU/ml (2013年11月已拿到新證)HCV 檢測下限：15 IU/ml (預計16年3月拿到新證),國家CFDA技術審評中心《HBV DNA/HCV RNA 定量試劑技術審評指導原則》中指出： HBV DNA最低

5、檢測限應 ≤30IU/ml HCV RNA最低檢測限應 ≤50IU/ml,PKI臨床高敏定量檢測產(chǎn)品,,,,,,HBV產(chǎn)品性能,高敏乙肝試劑對比試驗開展單位,北京大學醫(yī)學部上海仁濟醫(yī)院湖北省人民醫(yī)院上海第三人民醫(yī)院溫州醫(yī)科大附屬第一醫(yī)院東營勝利油田中心醫(yī)院昆明醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院滄州傳染病醫(yī)院中山大學附屬第一醫(yī)院北京三零二醫(yī)院,高敏乙肝試劑對比試驗開展單位,浙江PCR培訓班現(xiàn)場評價重慶PCR培訓班現(xiàn)場評

6、價廣州PCR培訓班現(xiàn)場評價煙臺PCR培訓班現(xiàn)場評價,一、北大醫(yī)學部,臨床血清盤評價,線性范圍評價,Day 1:,Genotype A Panel: WHO HBV Standard（NIBSC code: 10/264）稀釋均采用HBV 陰性人EDTA抗凝血漿：HBsAg negative and anti-HBcAb negative,Day 2 & 3: repeat the above testing pattern

7、,1. WHO 標準血清盤可溯源性檢測方案,,該HBV定量試劑具有良好的溯源性,PKI HBV定量試劑對WHO標準品溯源性檢測結果,靈敏度 WHO標準品（A亞型）,Day 1:,Genotype B:衛(wèi)生部臨床檢驗中心（GBW09150）Genotype C:中國藥品生物制品檢定研究院Genotype D: SeraCare公司（ WWHD301-10 ）,Day 2 & 3: repeat the above testi

8、ng pattern,2. HBV B/C/D亞型的重復性比較方案,PKI HBV定量試劑對HBV B/C/D亞型標準血漿檢測精密度評價,該HBV定量試劑具有良好的重復性,,,,,,,重復性 臨檢中心標準品（B亞型）,3. 線性范圍評價方案,改良Doumas法,該試劑的線性范圍可達到（20~1E+09）IU/ml,線性范圍分析,改良Doumas法,線性范圍圖,4. 臨床血清盤評價,,雙盲法對比測試84例臨床樣本符合率100%其中2

9、例樣本低于兩種檢測試劑的檢測下限20 IU/ml，兩種試劑均可檢出。Deming regression（圖）分析結果顯示：兩中試劑的相關性較好（r=0.968，p<0.0001）；二者關系為PKI=0.340+0.975*Roche；,Correlation with Roche,該HBV定量檢測試劑在溯源性、精密度及線性范圍方面均有良好表現(xiàn)，臨床樣本檢測與進口試劑具有良好的相關性。,試劑考評結論,二、上海仁濟醫(yī)院,Genoty

10、pe A Panel: WHO HBV Standard（NIBSC code: 10/264）稀釋均采用HBV 陰性人EDTA抗凝血漿：HBsAg negative and anti-HBcAb negative,1. WHO 標準品準確度檢測方案,該HBV定量試劑具有良好的溯源性和準確度,PKI HBV定量試劑準確度檢測結果,,Day 2 & 3 & 4: repeat the above testing patt

11、ern,2. 重復性比較方案,Day 1: 直接測試16次,批內重復性檢測結果,該HBV定量試劑具有良好的重復性,,(Coefficient of Variance),批間重復性檢測結果,該HBV定量試劑具有良好的重復性,,3. 線性范圍評價方案,改良Doumas法,該試劑的線性范圍可達到（20~1E+09）IU/ml,線性范圍分析,Correlate,4. 臨床樣本評價方案,8次方濃度樣本8個,PKI,3次方濃度樣本8個,7次方濃度樣

12、本8個,2次方濃度樣本8個,6次方濃度樣本8個,5次方濃度樣本8個,4次方濃度樣本8個,1次方濃度樣本8個,Roche,對比,,臨床對比結果,臨床對比結果,5. 檢測限評價方案,Genotype A Panel: WHO HBV Standard（NIBSC code: 10/264）稀釋均采用HBV 陰性人EDTA抗凝血漿：HBsAg negative and anti-HBcAb negative,Repeat 3,Repeat

13、4,檢測限結果,,,,三、湖北省人民全血測評結果 on Chemagic 360,相對于過柱法提取，磁珠方法提取全血有更高的得率,湖北省人民全血測評結果 on Chemagic 360,將全血原倍樣本重復提取3次測試，并稀釋5倍、10倍測試，結果表明磁珠方法提取全血具有更好的重復性、梯度關系,湖北省人民全血測評結果 on Chemagic 360,四、北京302醫(yī)院—精密度,四、北京302醫(yī)院—臨床樣本對比,四、北京302醫(yī)院—

14、棋盤交叉污染測評,Unbeatable Solution,Magnet offRotation on,Magnet on,Magnetic Beads based on (PVA),~ 1 µm,,chemagic Separation Technology,BloodSaliva / SwabsPlasma(Pathogens),Standard Kits for:,Pre-NAT技術特點-3,轉移磁珠而不采用轉移液

15、體的方式進行核酸提取，可以有效的減少氣溶膠的產(chǎn)生幾率，具有良好的防污染效果，而且可以極大的減少樣本處理時間。,用旋轉磁棒的方式進行液體攪拌，從而確保磁珠完全重懸并釋放雜質。能夠避免磁棒振動模式混勻、或者吹吸混勻的氣溶膠產(chǎn)生的風險。通過電磁鐵控制磁場，磁珠被轉移到下一個提取組分中，無需轉移液體。,防污染措施,1. 紫外燈消毒，有效防止交叉污染。2. 磁棒旋轉式混勻，液面上升幅度小，可防止液體噴濺。3. 轉移磁珠的方法，減少了液體/氣溶

16、膠暴露的機會，從而減少污染。4. 廢棄槍頭處理方式：直接打到專用垃圾袋，防止含病原體的槍頭污染臺面。5. 每次實驗后進行儀器清潔：75%酒精擦拭臺面。6. 使用濾芯槍頭。7. MSM1排風口引到pre-NAT外部，防止氣流回流造成污染。8. 設有移液回吸動作，防止陽性樣本滴出造成污染。,表1 相對符合率分析,五、與國內煮沸法HBV 低于500 IU/ml 樣本結果測評分析,簡要分析：國產(chǎn)試劑HBV PCR試劑20IU/ml濃

17、度以上假陰性率達到64%以上，且個別結果達到E4 E5高濃度樣本漏檢；,可見普通煮沸法HBV 定量試劑臨床漏檢率特別高，給臨床診治帶來錯誤的診斷治療依據(jù)。,表2 相對符合率分析,與一步法 HBV PCR試劑 樣本結果測評對比分析-1,一步法 HBV PCR試劑對比情況分析： PE與一步法平行對比HBV樣本，總計286例；一步法定量下限500IU/ml，即有156個樣本報陰性或無結果，PE定量下限20IU/ml，總計64個樣本不報結

18、果。實際有92個弱陽性標本被漏報，占總檢測數(shù)量的32.17%，風險相當大；,,國產(chǎn)：曲線平臺期不明顯，擴增效率低 重復性一般。,PE：曲線呈典型S曲線，擴增效率高 重復性非常好,一步法 HBV PCR試劑對比情況分析：兩例樣本結果兩種試劑差異較大，復測；一步法HBV試劑檢測準確性差，因雜質未去除，試劑抗干擾能力差，重復性差，不穩(wěn)定。PE HBV 高敏試劑抗干擾能力強，穩(wěn)定，重復性好。,與

19、一步法 HBV PCR試劑 樣本結果測評對比分析-2,超靈敏的PCR（即高效率）需要的各種條件較高:,{(1+x)n=AF ，109 PCR產(chǎn)物分子},高靈敏的關鍵要素,PerkinElmer 全自動核酸檢測反應體系構建系統(tǒng)-Pre-NAT,儀器型號：Pre-NAT條碼掃描：原始管上機，條碼掃描讀取儀器大?。?300mm x 810mm x 950mm樣本通量：1~96個樣本處理體積： 最大1.2ml液體加樣范圍：5u

20、l~800ul處理時間：2小時完成96個樣本的PCR體系構建加樣器：4通道磁場控制：電磁鐵提取方法：磁珠法---轉移磁珠,,,,,,,Pre-NAT 工作流程,Pre-NAT 工作站核酸提取、擴增前PCR反應體系構建等過程無需人工操作將您從繁瑣的操作中解放出來,,Walk away,Pre-NAT 四大模塊,Pre-NAT 操作界面,客戶操作流程--全自動核酸提取工作站,啟動客戶端軟件,點擊開始按鈕運行儀器,Pre-NAT完

21、成試劑分裝、樣本提取、PCR反應液準備,根據(jù)軟件提示完成1. 選擇所需程序2. 擺放所需耗材及試劑3. 掃碼工作,PCR擴增,,約 5~10 min,約120min,約90min,人工操作,Walk away,Accusense（精確液面感應）技術,可以感應電離液和非電離液（如DMSO/甲醇等）。可以設置高，中，低等感應靈敏度。可探測的最小體積試管中100µL微孔板中50µL,每個通道取樣頭均具有液面感

22、應功能，可獨立探測液面并在Z軸方向獨立運動，保證可同時操作具不同液面高度的離心管，減少一次性吸頭外壁的吸附，精確移液。,Pre-NAT技術特點-2,JANUS? 4道移液臂（Varispan Arm）：Varispan（移液頭間距調整）技術,自動調節(jié)Tip頭間的間距： 9 -20 mm (4 通道) 9 -40 mm (8 通道),Pre-NAT其他技術特點,Pre-NAT其他技術特點,模塊化設計,模

23、塊化設計，通過智能計算模塊位置精準定位。儀器內部配件、載架均可移到外部進行沖洗。從而更有效的做到防止交叉污染。,安全門設計,儀器門意外打開，或按緊急制動按鈕時，自動暫停程序，排除意外后程序繼續(xù)進行，不會造成整批樣本報廢的情況。,Our mission…,,,,,,,We are taking action to improve the health and safety of people and the environment.為