黃酮類化合物UGT與SULT代謝相互作用及其SULT代謝種屬和性別差異.pdf

1、黃酮類化合物(flavonoids)廣泛存在于植物界中,如蔬菜、水果、大豆堅果以及天然植物中,部分陸生維管束植物和部分苔蘚中也含有黃酮類化合物,另外又可作為食品添加劑成為保健食品。它是一種天然有機(jī)化合物,生理活性多種多樣,具有抗炎、抗菌、抗衰老、抗病毒、抗腫瘤、降低血膽固醇,增強(qiáng)骨強(qiáng)度等多種藥理活性,特別是黃酮類化合物的抗氧化性質(zhì)已經(jīng)受到國內(nèi)外醫(yī)藥界越來越密切的關(guān)注,其極有希望被開發(fā)成為臨床用化學(xué)預(yù)防或化學(xué)治療藥物,然而市場上并未有此種

2、藥物上市,最主要的因為來自于較低的生物利用度,許多研究包括我們實驗室在內(nèi)已經(jīng)證明:包括UGTs和SULTs在內(nèi)的Ⅱ相代謝酶引起的首過效應(yīng)是其生物利用度低(<10％)的主要因素。然而包括中國在內(nèi)的很多國家對于有效黃酮類成份在體內(nèi)外的代謝特性,作用機(jī)理,構(gòu)效關(guān)系等缺乏基礎(chǔ)性深入研究。因此,揭示黃酮類化合物的吸收和代謝機(jī)制對進(jìn)一步了解黃酮的功效機(jī)制和開發(fā)新藥將提供有益的指導(dǎo),并為開發(fā)良好的黃酮類新藥打下堅實的基礎(chǔ)。本論文從藥物代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)深

3、入探討黃酮類化合物的代謝規(guī)律及潛在的代謝機(jī)理,為臨床前研究及臨床安全用藥提供基本的理論基礎(chǔ)。
　　 黃酮類化合物的體內(nèi)代謝非常復(fù)雜,而經(jīng)尿苷二磷酸葡萄糖苷酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-Glucuronosyl transferase,UGT)催化生成葡萄糖醛酸苷以及經(jīng)磺基轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferase,SULT)催化生成硫酸鹽是導(dǎo)致該類化合物生物利用度低的主要因為。另外,也有文獻(xiàn)報道,7-羥基黃酮和非瑟酮經(jīng)吸收后被快速轉(zhuǎn)化為磺酸化

4、以及葡萄糖醛酸化衍生物,導(dǎo)致其口服生物利用度降低；口服含槲皮素的食物后,檢測發(fā)現(xiàn)幾乎所有的槲皮素被代謝為磺酸化共軛體或葡萄糖醛酸化共軛體；5-羥基黃酮以及白楊素(5,7-雙羥基黃酮)經(jīng)吸收后轉(zhuǎn)化為葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物等；還有報道指出,異黃酮類化合物的Ⅱ相葡萄糖醛酸化代謝受羥基取代位置的影響,同時受不同UGT酶亞型的影響；Wang等人報道,7-羥基香豆素在不同種屬包括人,狗,猴,大鼠,小鼠在內(nèi)的Ⅱ相葡萄糖醛酸化及磺酸化代謝均存在顯著的種屬

5、差異性,之前的研究也表明性別不同可以影響代謝酶的活性和選擇性；Lin等人發(fā)現(xiàn)Clivorine在體外的代謝同樣存在種屬差異性。
　　 因此本論文選擇了12種黃酮類化合物(3-HF,5-HF,6-HF,7-HF,2’-HF,3’-HF,4’-HF,3,4’-diHF,3,7-diHF,4’7-diHF,5,7-diHF,6,7-diHF)作為模型化合物,研究了黃酮類化合物的UGT代謝,SULT代謝以及二者代謝的相互作用關(guān)系,并比較

6、了黃酮類化合物SULT代謝的種屬和性別差異,得到結(jié)論如下:
　　 1.黃酮類化合物的UGT代謝研究運用FVB小鼠肝臟S9微粒體對包括7種單羥基黃酮和5種雙羥基黃酮在內(nèi)的12種黃酮類化合物的UGT代謝規(guī)律及代謝機(jī)理進(jìn)行研究。結(jié)果顯示:每種單羥基黃酮均檢測到一個葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物,除4’,7-diHF、5,7-diHF檢測到一個葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物外,3,4’-diHF,3,7-diHF,6,7-diHF均檢測到兩個葡萄糖醛酸化代

7、謝產(chǎn)物。
　　 其中7HF在FVB小鼠肝臟S9中的葡萄糖醛酸化代謝速率是7種HFs中最快的,5HF的UGT代謝速率是7種HFs中最慢的,在底物濃度為5μM和10μM時,7種HFs的葡萄糖醛酸化代謝速率順序為:7HF>3HF>3’HF>4’HF>2’HF>6HF>5HF,且HFs間存在顯著性差異(F5μM=469.683,P5μM<0.001；F10μM=361.015,P10μM<0.001)；底物濃度為40μM時,除7HF代謝

8、最快、5HF代謝最慢外,其代謝速率順序變化為7HF>3’HF>4’HF>6HF≈3HF>2’HF>5HF(F=437.787,P<0.001)。結(jié)果表明,7種HFs在FVB小鼠肝臟S9中的UGT代謝存在顯著的底物結(jié)構(gòu)-代謝活性相關(guān)性。另外,5種雙羥基黃酮中,7位-OH葡萄糖醛酸化代謝仍然是其它位置-OH中(3位,5位,6位,4’位)取代速率最快的,其-OH取代代謝速率順序為:7-OH>3-OH>6-OH/4’-OH,且diHFs問存在顯

9、著性差異(F5μM=2.769,PμM=0.057除外,F10μM=3.126,P10μM=0.039,F40μM=4.442,P40μM=0.011),因此5種diHFs在FVB小鼠肝臟S9中的UGT代謝同樣存在顯著的底物結(jié)構(gòu)-代謝活性相關(guān)性(5μM除外)。7位-OH總是被代謝最快,其因為可能與7位-OH是UGT酶活性識別位點有關(guān)；5位-OH總是被代謝最慢,同時在5,7-diHF中,沒有檢測到5位-OH被葡萄糖醛酸化,因為可能為5位-

10、OH與C-4位形成分子內(nèi)氫鍵,C-4羰基形成空間位阻阻礙5位-OH葡萄糖醛酸化所致。
　　 同時我們考察了12種羥基黃酮UGT代謝的濃度依賴性特征,發(fā)現(xiàn)7-HF,4-’HF,3’-HF,6-HF,5-HF5種單羥基黃酮及5種雙羥基黃酮的葡萄糖醛酸化代謝特征均遵循底物濃度順代謝反應(yīng)速率圖,2’HF遵循代謝速率在底物濃度為中間濃度時(10μM)達(dá)到最大,且濃度間存在顯著性差異。
　　 在3,7-diHF,4’,7-diHF,

11、5,7-diHF及6,7-diHF四種雙羥基黃酮中,當(dāng)3,4’,5,6位有-OH存在下,7位-OH的葡萄糖醛酸化代謝與7HF比較,代謝速率降低,其降低程度由慢到快分別為3位慢于6位,接著慢于4’位及5位,同單羥基黃酮的UGT代謝類似,3HF的UGT代謝快于6HF,4’HF及5HF,換句話說,當(dāng)多一個7位-OH取代時,7位-OH取代速率為3,7-diHF>6,7-diHF>4’,7-diHF及5,7-diHF,但均慢于7HF中7位-OH取

12、代,這說明3,4’,5,6位被羥基取代時即增加一個酚羥基團(tuán)后,可能改變母核結(jié)構(gòu)中A環(huán)的電子云密度,從而抑制7位-OH的葡萄糖醛酸化代謝。
　　 2.黃酮類化合物的SULT代謝研究運用FVB小鼠肝臟S9微粒體對12種羥基黃酮類化合物的SULT代謝規(guī)律及代謝機(jī)理進(jìn)行研究。結(jié)果顯示,除3HF外,另外6種單羥基黃酮(7HF,3’HF,4’HF,2’HF,6HF,5HF>均檢測到一個磺酸化代謝產(chǎn)物；除4’,7-diHF檢測到兩個磺酸化代謝

13、產(chǎn)物外,3,4’-diHF,3,7-diHF,5,7-diHF,6,7-diHF均檢測到一個磺酸化代謝產(chǎn)物。
　　 其中7HF在FVB小鼠肝臟S9中的磺酸化代謝速率是6種HFs中最快的,6HF的SULT代謝速率是6種HFs中最慢的,3HF未檢測到磺酸化代謝產(chǎn)物。如在底物濃度為5μM和10μM時,7種HFs的磺酸化代謝速率順序為:7HF>4’HF>2’HF>SHF>3’HF>6HF>3HF=0,且HFs間存在顯著性差異(F5μM=

14、285.476,P5μM<0.001；F10μM=237.350,P10μM<0.001)；雙羥基黃酮中,7位-OH磺酸化代謝仍然是其它位置-OH(4’位,3位,5位,6位)中取代速率最快的,其中4’,7-diHF中7-O-S的取代速率快于4’-O-S,如在底物濃度為5μM和10μM時,-OH取代代謝速率順序為:7-O-S of6,7-diHF>7-O-S of4’,7-diHF>4’-O-S of4’,7-diHF>7-O-S of3

15、,7-diHF>7-O-S of5,7-diHF>4’-O-S of3,4’-diHF,且diHFs間存在顯著差異(F5μM=66.164,P5μM<0.001；F10μM=23.895,P10μM<0.001；F40μM=3.941,P40μM=0.026)；其中7位-OH總是被代謝最快,然后是4’位-OH,在有7位-OH存在的情況下沒有檢測到3位,5位,6位-OH被磺酸化,因為可能為:對于3位-OH來說,單羥基3HF目前檢測不到磺酸

16、化代謝產(chǎn)物,可能由于3位空間位阻過大；對于5位-OH來說,可能與C-4位形成分子內(nèi)氫鍵,空間位阻增大阻礙5位-OH磺酸化；對于6位-OH來說,可能由于6位已發(fā)生磺酸化代謝,但代謝速率太慢或代謝量太少,目前的檢測方法無法檢測到。結(jié)果表明,6種HFs(3HF除外)及5種diHFs在FVB小鼠肝臟S9中的SULT代謝均存在顯著的底物結(jié)構(gòu)-代謝活性相關(guān)性。
　　 關(guān)于11種羥基黃酮(3HF除外)的SULT代謝濃度依賴性特征,研究發(fā)現(xiàn)5H

17、F為底物濃度順代謝反應(yīng)速率圖,4’HF,7HF,6HF,2’HF,3’HF5種單羥基黃酮以及5種雙羥基黃酮(除3,7-diHF中7位取代未發(fā)生顯著性變化外)為底物濃度逆代謝反應(yīng)速率圖,且濃度間存在顯著性差異(P<0.05)。
　　 在3,7-diHF,4’,7-diHF,5,7-diHF及6,7-diHF四種雙羥基黃酮中,當(dāng)4’位,6位有-OH存在下,7位-OH的磺酸化代謝與7HF比較,代謝速率升高；當(dāng)3位,5位有-OH存在下,

18、7位-OH的磺酸化代謝與7HF比較,代謝速率降低,我們推測當(dāng)3,4’,5,6位被羥基取代時即增加一個酚羥基團(tuán)后?？赡芨淖兡负私Y(jié)構(gòu)中A環(huán)的電子云密度且改變的方向或程度存在差異性,即4’位,6位分別與7位被羥基取代時,4’位,6位-OH促進(jìn)了7位-OH的磺酸化代謝；當(dāng)3位,5位分別與7位被-OH取代時,3位,5位-OH抑制了7位-OH的磺酸化代謝。
　　 3.黃酮類化合物的UGT與SULT代謝相互作用研究運用FVB小鼠肝臟S9微粒體

19、對12種羥基黃酮類化合物的UGT與SULT代謝相互作用規(guī)律及代謝機(jī)理進(jìn)行研究。結(jié)果顯示,同UGT單一反應(yīng)體系和SULT單一反應(yīng)體系結(jié)果相類似:在UGT與SULT聯(lián)合反應(yīng)體系中,羥基黃酮類化合物的磺酸化代謝及葡萄糖醛酸化代謝均存在顯著的底物結(jié)構(gòu)-代謝活性相關(guān)性以及底物濃度-代謝活性依賴性。關(guān)于底物結(jié)構(gòu)-代謝活性相關(guān)性,單羥基黃酮在聯(lián)合反應(yīng)體系中由于另一代謝的存在使部分單羥基黃酮代謝的結(jié)構(gòu)依賴性順序發(fā)生變化,而雙羥基黃酮的代謝順序未發(fā)生顯著

20、性變化；關(guān)于底物濃度-代謝活性依賴性,UGT代謝仍然以底物濃度順代謝反應(yīng)速率特性為主,SULT代謝仍然以底物濃度逆代謝反應(yīng)速率特性為主,少部分黃酮的底物依賴性特征發(fā)生改變?nèi)?’HF。
　　 本章節(jié)最重要的發(fā)現(xiàn)是:在FVB小鼠肝臟S9微粒體中,無論是單羥基黃酮或雙羥基黃酮,當(dāng)Ⅱ相磺酸化代謝與葡萄糖醛酸化代謝同時發(fā)生時(在體內(nèi)兩者代謝是同時進(jìn)行的),葡萄糖醛酸化代謝在一定程度上促進(jìn)磺酸化代謝的代謝速率(除2’HF10μM及7-O-S

21、 of3,7-diHF和4’,7-diHF5μM外),而其本身的代謝速率變化不明顯或降低,具體機(jī)制尚不明確,需進(jìn)一步探討。
　　 4.黃酮類化合物SULT代謝的種屬差異性與性別差異性研究實驗選取了不同性別的dog,rat,mouse,human四種種屬的肝臟S9微粒體,考察7HF,6HF,4’HF的SULT代謝的種屬差異性與性別差異性。結(jié)果顯示,3種羥基黃酮的SULT代謝存在顯著的種屬差異性(P<0.05),對7HF和6HF來說

22、,不同種屬代謝快慢順序為:dog>rat>human>mouse；對4’HF來說,濃度在10μM及40μM時,不同種屬SULT代謝快慢順序為:dog>rat>mouse>humam;5μM時,代謝順序變化為dog>mouse>rat>human。
　　 同時比較了相同種屬不同性別動物肝臟S9微粒體對3種HFs SULT代謝的性別差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在大鼠肝臟S9中,無論是7HF,6HF或4HF,雄性組磺酸化代謝速率均快于雌性組；在小

23、鼠肝臟S9中,無論是7HF,6HF或4HF,雌性組磺酸化代謝速率均快于雄性組(P<0.05)；在狗肝臟S9中,除7HF40μM和6HF40μM外,雄性組磺酸化代謝速率與雌性組比較變化不明顯；因此,羥基黃酮SULT代謝存在顯著的性別差異性。
　　 結(jié)論:本論文第一次系統(tǒng)的,深入的考察了有效黃酮類成份的UGT代謝,SULT代謝特征,代謝規(guī)律及代謝機(jī)理,首次提出UGT與SULT代謝之間的相互作用關(guān)系,同時闡述了黃酮類化合物在不同動物種