黃酮類(lèi)化合物和腎上腺素與蛋白質(zhì)相互作用及其分析應(yīng)用的研究.pdf

1、銀杏黃酮類(lèi)化合物(flavonoids)是銀杏葉提取物(Ginkgo BilobaExtract，GBE)中有效成分之一，具有廣泛的藥理作用。它們不僅能預(yù)防腦血栓、心肌梗塞等心血管疾病，而且能抑制血小板活化因子(Pletalet ActivatingFactor，PAF)，所以銀杏葉提取物及其制劑的質(zhì)量備受關(guān)注。而現(xiàn)行的分析方法存在靈敏度低和耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題。因此，建立一種快速靈敏的分析方法是非常必要的。基礎(chǔ)藥理學(xué)研究表明，銀杏葉制劑對(duì)氣管

2、和支氣管的擴(kuò)張作用是通過(guò)影響腎上腺素系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，準(zhǔn)確而靈敏地測(cè)定體內(nèi)腎上腺素含量，可為銀杏葉制劑的基礎(chǔ)藥理學(xué)研究和臨床藥理學(xué)研究提供有價(jià)值的參考依據(jù)蛋白質(zhì)是藥物的一種非常重要的載體，藥物與蛋白質(zhì)的相互作用不僅影響藥物在體內(nèi)的分布、代謝與排泄方式，而且影響藥物在體內(nèi)的生理活性。因此，研究黃酮類(lèi)化合物和腎上腺素與蛋白質(zhì)的相互作用以及快速而靈敏的測(cè)定方法可為合理給藥提供理論依據(jù)。 本論文利用熒光技術(shù)、同步熒光技術(shù)、熒光猝滅技術(shù)、共振

3、光散射技術(shù)、熒光偏振技術(shù)、熒光壽命、圓二色譜和吸收光譜等多手段研究了黃酮類(lèi)化合物和腎上腺素與蛋白質(zhì)的作用機(jī)理：建立了用熒光光度法測(cè)定銀杏黃酮、腎上腺素和牛血清蛋白(BSA)的熒光新方法。本論文共分六章： 第一章：綜述了(1)銀杏黃酮類(lèi)化合物提取及分析方法的研究進(jìn)展：(2)藥物與蛋白質(zhì)的相互作用研究方法的發(fā)展趨勢(shì)；(3)腎上腺素各種測(cè)定方法應(yīng)用情況：(4)稀土離子共發(fā)光效應(yīng)及蛋白質(zhì)的配合物熒光探針。共引用文獻(xiàn)87篇。 第二

4、章：建立了用熒光光度法測(cè)定銀杏黃酮含量的新方法。將銀杏葉提取物經(jīng)酸性條件下加熱水解，使黃酮苷轉(zhuǎn)化為苷元再與Al<'3+>配位，所形成的配合物具有很強(qiáng)的熒光。用槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)品，采用熒光光度法測(cè)定其總黃酮含量。在選定條件下，槲皮素的濃度與熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系，線性范圍0.00075-0.50μg/ml，檢出限0.45 ng/ml(S/N=3)，回歸方程I<,r>=7.79948+63.21086C×10<'2>(μg/ml)，相關(guān)系數(shù)r=0.

5、99994，換算為銀杏葉提取物中總黃酮苷的線性范圍為0.0019-1.2μg/ml，檢出限1.1ng/ml。并用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)和銀杏葉提取物(GBE)中的總黃酮含量的測(cè)定，與高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果基本一致。 本方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，檢出限比HPLC-UV法低近兩個(gè)數(shù)量級(jí)，適用于銀杏葉及其提取物(GBE)中總黃酮含量的測(cè)定。第三章：采用熒光猝滅技術(shù)，根據(jù)Stern-Volmer方程分別求得不同溫度下槲皮素(Que)和G

6、BE與牛血清白蛋白的相互作用結(jié)合常數(shù)及結(jié)合點(diǎn)數(shù)；利用Vant Hoff方程求得了作用的熱力學(xué)常數(shù)，確定了它們與血清白蛋白(BSA)之間的作用力類(lèi)型；利用FSrster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，分別求得它們與BSA之間的作用距離：并通過(guò)同步熒光光譜、紫外一可見(jiàn)光譜和圓二色譜技術(shù)討論了Que和GBE對(duì)牛血清白蛋白構(gòu)象的影響。 第四章：提出了測(cè)定腎上腺素新的熒光光度法。實(shí)驗(yàn)表明，腎上腺素在酸性介質(zhì)中與甲醛發(fā)生縮合反應(yīng)，縮合產(chǎn)物在pH=9.5

7、的硼砂緩沖溶液中被鐵氰化鉀氧化生成強(qiáng)的熒光體：在實(shí)驗(yàn)中，加入抗壞血酸溶液還原過(guò)剩的K<,3>Fe(CN)<,6>，以便穩(wěn)定熒光。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，體系的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為428nm和498nm，腎上腺素的濃度在1.4×10<'-9>～2.1×10<'-6>mol/l范圍內(nèi)與體系的熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，檢出限為2.4×10<'-10>mol/l(4.3×10<'-11>g/ml，S/N=3)，它明顯低于傳統(tǒng)熒光方法的檢出限。另外，還對(duì)反應(yīng)

8、的機(jī)理進(jìn)行了研究。 第五章：研究了Tb-Gd-E-Tris體系中的共發(fā)光效應(yīng)，建立了一種測(cè)定腎上腺素的熒光新方法。實(shí)驗(yàn)表明，在Gd<'3+>存在下，腎上腺素使Tb<'3+>的特征熒光得到明顯增強(qiáng)。。腎上腺素的濃度在1.8×10<'-8>～2.5×10<'-6>mol/l范圍內(nèi)與Tb<'3+>的熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，體系的檢出限為4.5×10<'-9>mol/l(S/N=3)，與其它已見(jiàn)報(bào)道的熒光方法相比，該方法靈敏度較高、操作簡(jiǎn)便

9、，將該法用于實(shí)際樣品中腎上腺素的測(cè)定，結(jié)果令人滿(mǎn)意。另外，還對(duì)本體系的稀土共發(fā)光的機(jī)理進(jìn)行了探討。 第六章：利用Tb<'3+>-腎上腺素(E)配合物作為蛋白質(zhì)的熒光探針，建立了一種測(cè)定牛血清牛蛋白(BSA)的熒光新方法。實(shí)驗(yàn)中加入熒光穩(wěn)定劑抗壞血酸(AA)和熒光增敏劑十二烷基硫酸鈉(SDS)來(lái)提高測(cè)定蛋白質(zhì)的靈敏度。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，建立了BSA的濃度與體系熒光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系，并進(jìn)行了回歸分析，其回歸方程y=42.399+1

10、4.3675×10<'9>C，相關(guān)系數(shù)0.9997，線性范圍為8.0×10<'-11>～2,5×10<'-7>mol/l(5.2×10<'-9>～1.3×10<'-5>g/ml)，檢出限為2.0×10<'-11>mol/l(1.3×10<'-9>g/ml)(S/N=3)。與其它常見(jiàn)的熒光方法相比，該法具有較高的靈敏度。將該法用于實(shí)際樣品中蛋白質(zhì)的測(cè)定，結(jié)果令人滿(mǎn)意。機(jī)理研究表明，Tb<'3+>-E配合物通過(guò)靜電引力與蛋白質(zhì)發(fā)生作用，蛋白

11、質(zhì)與SDS為該配合物提供了一個(gè)較好的疏水性微環(huán)境，從而使得體系的熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。本論文的主要特點(diǎn)： (1)建立了以槲皮素作為標(biāo)準(zhǔn)品用熒光光度法測(cè)定銀杏黃酮含量的新方法。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高： (2)用熒光光譜、紫外一可見(jiàn)光譜和圓二色譜等多種方法研究了槲皮素和銀杏葉提取物與牛血清白蛋白的相互作用，測(cè)得了它們間的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合距離，確定了結(jié)合力性質(zhì)； (3)利用甲醛、鐵氰化鉀和抗壞血酸分別作為縮合