OAB患者膀胱黏膜M1-5受體亞型測(cè)定及其臨床意義.pdf

1、研究背景:
　　 膀胱過度活動(dòng)癥(overactive bladder,OAB)是以尿急癥為特征的癥候群,伴有或不伴有急迫性尿失禁,常伴有日間尿頻、夜尿癥。
　　 在下尿路癥狀中,OAB癥狀最常見,且對(duì)患者的日常生活影響最大。OAB對(duì)于醫(yī)療保健系統(tǒng)來說也是一個(gè)沉重的負(fù)擔(dān),其社會(huì)經(jīng)濟(jì)花費(fèi)與用于糖尿病或癡呆癥的費(fèi)用大致相當(dāng)。近一半患者訴OAB癥狀顯著影響日常生活。
　　 目前治療OAB的主要藥物是毒蕈堿膽堿能受體(m

2、uscarinic receptor；M受體)拮抗劑,但其作用機(jī)理仍未明確。
　　 傳統(tǒng)理論認(rèn)為,OAB癥狀是由逼尿肌過度活動(dòng)引起的。M受體拮抗劑的作用部位是膀胱逼尿肌,即阻斷膀胱逼尿肌上突觸后(傳出神經(jīng))M受體,進(jìn)而抑制由副交感神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿所誘導(dǎo)的逼尿肌收縮。
　　 但是傳統(tǒng)理論無法解釋為什么口服M受體拮抗劑在改善OAB患者的尿頻、尿急等膀胱感覺癥狀的同時(shí),而很少發(fā)生尿潴留?
　　 膀胱感覺與

3、傳入神經(jīng)通路有關(guān),因此有學(xué)者推測(cè)M受體拮抗劑對(duì)傳入途徑也有作用,這在臨床和實(shí)驗(yàn)中都得到了支持:
　　 Fader M等發(fā)現(xiàn):膀胱灌注非選擇性M受體拮抗劑阿托品在增加的膀胱容量方面,與口服奧昔布寧有相等效應(yīng),但膀胱灌注組副作用更少,患者生活質(zhì)量改善更明顯。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),膀胱灌注阿托品不影響正常鼠的排尿生理,即使是大劑量灌注也僅僅是降低膀胱收縮幅度而已。
　　 現(xiàn)在有研究提示,膀胱黏膜上皮層Ach釋放增多,上皮及上皮下成肌纖

4、維細(xì)胞M受體改變,膀胱傳入神經(jīng)活動(dòng)增加,可能是產(chǎn)生OAB癥狀的原因。有人推測(cè)OAB患者膀胱黏膜M受體也發(fā)生了變化。
　　 M受體有M1-M5五種亞型。人膀胱黏膜表達(dá)所有的M受體亞型mRNA。但病理狀態(tài)下人的膀胱黏膜M受體亞型表達(dá)的報(bào)道仍較少,且結(jié)果(見下)存在矛盾之處:
　　 Mukelji G等報(bào)道IDO(idiopathic detrusor overactivity,特發(fā)性逼尿肌過度活動(dòng))患者膀胱上皮下成肌纖維細(xì)胞

5、樣細(xì)胞M2、M3表達(dá)上調(diào),且與尿急、尿頻癥狀評(píng)分相關(guān)；上皮及逼尿肌M2、M3受體表達(dá)無變化。
　　 Soumendra N Datta等發(fā)現(xiàn)DO患者黏膜上皮下M1、M3受體表達(dá)下調(diào),且與尿急次數(shù)和24小時(shí)排尿次數(shù)負(fù)相關(guān)；膀胱上皮M1表達(dá)下調(diào)；上皮下M2輕微下調(diào)(無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。
　　 Kate H Moore等發(fā)現(xiàn)IDO女性患者膀胱黏膜M2表達(dá)無變化、M3表達(dá)下調(diào)。
　　 上述有關(guān)DO/IDO患者膀胱黏膜M受體檢

6、測(cè)的結(jié)果存在著明顯的矛盾,且都有一個(gè)共同特點(diǎn):那就是均來源于DO患者。
　　 DO指在儲(chǔ)尿期膀胱壓力.容積測(cè)定過程中逼尿肌出現(xiàn)無抑制性收縮。根據(jù)OAB的定義可以知道,診斷OAB是不需要尿動(dòng)力學(xué)檢查的,同時(shí)找不到明確病因才能診斷OAB。只有54.2％OAB患者尿動(dòng)力學(xué)檢查到DO,而僅27.5％的DO患者存在OAB癥狀。
　　 因此,DO不能等同于OAB。因此,DO不能等同于OAB。也就是說,迄今為止,國際上尚未有真正的有關(guān)

7、OAB患者膀胱黏膜M受體檢測(cè)的報(bào)道。
　　 研究目的和意義:
　　 對(duì)于OAB的發(fā)病機(jī)理,通常認(rèn)為是逼尿肌過度活動(dòng)導(dǎo)致尿急、急迫性尿失禁等OAB癥狀。所以,人們普遍推測(cè)M受體(muscarinic receptor,毒蕈堿膽堿能受體)拮抗劑的作用部位是膀胱逼尿肌,即阻斷逼尿肌上的M受體,減少膀胱傳出神經(jīng)的活動(dòng),從而抑制逼尿肌的收縮。
　　 但是,臨床上發(fā)現(xiàn),口服建議劑量的M受體拮抗劑能改善OAB患者的尿頻、尿急、

8、急迫性尿失禁癥狀并增加膀胱容量,而很少引起排尿困難或尿潴留；此外,膀胱灌注M受體拮抗劑阿托品能明顯改善逼尿肌過度活動(dòng)患者癥狀。這說明,M受體拮抗劑治療OAB的機(jī)理可能與抑制膀胱感覺通路(傳入神經(jīng)通路)有關(guān),即與阻斷膀胱黏膜M受體有關(guān)。
　　 目前對(duì)膀胱黏膜中M受體分布和功能還不清楚,僅有少數(shù)關(guān)于逼尿肌過度活動(dòng)患者膀胱黏膜中M受體亞型分布的研究,但他們的研究結(jié)果存在矛盾,對(duì)其臨床意義則更缺乏研究。也就是說,迄今為止,尚未有關(guān)于OA

9、B患者膀胱黏膜M受體亞型檢測(cè)的報(bào)道。
　　 綜上所述,本課題觀察OAB患者M(jìn)1-5受體亞型在膀胱黏膜中的表達(dá)變化,評(píng)估其與臨床癥狀、生活質(zhì)量間的關(guān)系,將有助于進(jìn)一步探討OAB的發(fā)病機(jī)制及M受體拮抗劑的作用機(jī)理；對(duì)改變M受體拮抗劑給藥途徑,提高其療效,降低其副作用,提高患者生活質(zhì)量都有重要意義。
　　 研究方法:
　　 選擇愿意參加本研究的OAB患者和無OAB癥狀的血尿或上尿路結(jié)石需要做膀胱鏡檢查的患者入組。患者來

10、源于2010-3月-2011年3月廣州市第一人民醫(yī)院泌尿外科就診的患者。
　　 將研究對(duì)象分為2個(gè)組:對(duì)照組11例、膀胱過度活動(dòng)癥組10例。
　　 OAB組的入選標(biāo)準(zhǔn):(1)患者主觀上存在有OAB癥狀(即尿急,伴或不伴有急迫性尿失禁,常伴有尿頻和夜尿癥),病史≥3個(gè)月；(2)尿液分析結(jié)果正常；(3)泌尿系B超檢查未見異常；(4)簽署知情同意書。正常對(duì)照組的排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有OAB癥狀；(2)有尿路感染患者；(3)糖尿病患

11、者；(4)神經(jīng)原性病變的患者；(5)前列腺增生癥患者；(6)尿動(dòng)力學(xué)檢查證實(shí)有膀胱出口梗阻及可疑梗阻的患者；(7)拒絕參加本實(shí)驗(yàn)研究者。
　　 OAB組的排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有尿路感染患者；(2)糖尿病患者；(3)神經(jīng)原性病變患者；(4)前列腺增生癥患者；(5)尿動(dòng)力學(xué)證實(shí)有膀胱出口梗阻及可疑梗阻的患者；(6)放射或化學(xué)性膀胱炎；(7)性傳播性疾病；(8)半年以內(nèi)使用過M受體拮抗劑藥物治療的患者；(9)拒絕參加本研究者。
　　

12、 對(duì)照組的入選標(biāo)準(zhǔn):(1)無OAB癥狀的血尿或上尿路結(jié)石患者；(2)需要做膀胱鏡檢查；(3)簽署知情同意書。
　　 正常對(duì)照組的排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有OAB癥狀；(2)有尿路感染患者:(3)糖尿病患者；(4)神經(jīng)原性病變的患者；(5)前列腺增生癥患者；(6)尿動(dòng)力學(xué)檢查證實(shí)有膀胱出口梗阻及可疑梗阻的患者；(7)拒絕參加本實(shí)驗(yàn)研究者。
　　 所有患者均記錄排尿日志,OABSS、King's問卷調(diào)查表,該記錄由同一醫(yī)師進(jìn)行,問

13、卷調(diào)查表采用詢問方式由醫(yī)師進(jìn)行填寫,排尿日志由患者自行填寫。所有標(biāo)本均通過膀胱鏡檢活檢獲得,統(tǒng)一在膀胱左側(cè)壁距左輸尿管口頭外側(cè)2cm處取得膀胱側(cè)壁黏膜,液氮保存。
　　 熒光定量PCR,方法:(1)組織總RNA制備:在勻漿器中加1ml Trizol試劑,活檢組織充分研磨至勻漿,加200ul氯仿后離心；異丙醇沉淀RNA。加75％乙醇洗滌沉淀離心；無RNase水溶解RNA,-80℃低溫冰箱保存。(2)RNA純度及完整性鑒定:樣品在E

14、ppendorf核酸蛋白定量?jī)x上測(cè)定OD260值及OD260、OD280比值行純度鑒定；凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA5s rRNA、18s rRNA、28s rRNA條帶行RNA完整性鑒定；(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)獲得cDNA片段；(4)采用設(shè)計(jì)引物行熒光定量PCR反應(yīng)；繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；確定M受體mRNA相對(duì)拷貝數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)化拷貝數(shù)。
　　 對(duì)OAB患者及對(duì)照組膀胱黏膜的M1-5受體mRNA標(biāo)準(zhǔn)化拷貝數(shù)進(jìn)行比較。對(duì)問卷調(diào)查表

15、結(jié)果進(jìn)行評(píng)估,分析其與M受體亞型mRNA表達(dá)情況之間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:
　　 本研究中OAB患者10例,正常對(duì)照組11例。OAB組平均年齡38.70±10.71歲；對(duì)照組平均年齡49.64±13.11歲；組間年齡差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.328,P=0.051)。
　　 對(duì)照組是女性6例,男性5例；而OAB組,女性7例,男性3例,組間性別差異比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(采用Fisher確切概率法,P=0.659)

16、。
　　 1、對(duì)照組及OAB患者膀胱黏膜M受體mRNA拷貝數(shù)組內(nèi)比較:
　　 如下表所示,OAB患者膀胱黏膜M受體亞型mRNA拷貝數(shù)由大到小依次為:M3>M4>M5>M2>M1。對(duì)照組組內(nèi)M受體亞型mRNA拷貝數(shù)則依次為:M3>M4>M5>M1>M2。從M受體亞型mRNA拷貝數(shù)排序來講,兩組間存在差異?？梢钥闯?在OAB組,M2受體mRNA拷貝數(shù)排序前移一位。
　　 不管是OAB還是對(duì)照組,膀胱黏膜中都是以M3、

17、M4、M5受體為主,其中M3受體最多。而且,M3同King's生活質(zhì)量評(píng)分第5、6部分相關(guān),Spearman'srho相關(guān)系數(shù)為0.788,0.654；P=0.035,0.040。
　　 2、OAB組與對(duì)照組兩組間膀胱黏膜M1-M5受體mRNA拷貝數(shù)比較,采用Mann-Whitney檢驗(yàn),OAB與對(duì)照組膀胱黏膜M1、M2、M3、M4、M5比較,Z值分別為-0.63；-1.28；-0.63；-0.85；-0.14。P值分別為0.5

18、57；0.222；0.557；0.426;0.918。兩組間M1-M5受體表達(dá)差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、OAB組患者M(jìn)1-M5受體mRNA拷貝數(shù)與癥狀間的相關(guān)性比較:
　　 OAB組患者OABSS總分7.70±3.16分；OABSS尿急癥狀評(píng)分3.50±2.07分； King’s生活質(zhì)量評(píng)分總分529.72±208.15分。
　　 M4同OABSS評(píng)分及尿急癥狀相關(guān),Spearman's rho相關(guān)系數(shù)為

19、0.740,0.723；P=0.014,0.018。
　　 King's生活質(zhì)量評(píng)分第5部分還與M4、M5受體表達(dá)相關(guān),Spearman's rho相關(guān)系數(shù)為0.788,0.768；P=0.035,0.044。
　　 主要結(jié)論:
　　 1、OAB患者組組內(nèi)膀胱黏膜M受體亞型mRNA拷貝數(shù)由大到小依次為:M3>M4>M5>M2>M1。對(duì)照組組內(nèi)則依次為:M3>M4>M5>M1>M2。兩組間M受體亞型排序存在差異。<

20、br>　　 在OAB組,M2受體mRNA拷貝數(shù)排序前移一位。M受體拮抗劑托特羅定對(duì)M2受體的拮抗作用強(qiáng)于M3受體,本結(jié)果可能對(duì)解釋托特羅定的療效和作用機(jī)理有幫助。
　　 OAB組和對(duì)照組膀胱黏膜中都是以M3、M4、M5受體為主,其中M3受體最多。而且,M3同King's生活質(zhì)量評(píng)分第5、6部分相關(guān),這說明臨床上廣泛使用的選擇性M3受體拈抗劑治療OAB時(shí)可能對(duì)膀胱黏膜也有作用。
　　 King's生活質(zhì)量評(píng)分第5、6部分

21、分別反映了排尿癥狀對(duì)個(gè)人生活、情感方面的影響。這為臨床上使用選擇性M3受體拮抗劑來改善患者生活質(zhì)量提供了理論依據(jù)。根據(jù)本研究結(jié)果,選擇性M3受體拮抗劑對(duì)個(gè)人生活,情感方面的改善可能更明顯。
　　 2、OAB組與對(duì)照組兩組間膀胱黏膜M1-M5受體表達(dá)的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、OAB患者膀胱黏膜M4同OABSS評(píng)分及尿急癥狀相關(guān)；King's生活質(zhì)量評(píng)分第5部分還與M4、M5受體表達(dá)相關(guān)。這說明M4、M5在OAB的發(fā)