基于受體蛋白MphR(A和E)的類ELISA構(gòu)建及在大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留檢測(cè)的初步應(yīng)用.pdf

1、長(zhǎng)時(shí)間大規(guī)模使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素將產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)。為了對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進(jìn)行有效及時(shí)監(jiān)管，需要發(fā)展各種檢測(cè)方法構(gòu)成完善的檢測(cè)方法網(wǎng)絡(luò)。
　　目前市場(chǎng)上大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留檢測(cè)方法有多種，但各種方法均存在相應(yīng)不足。利用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素調(diào)控蛋白MphR(A)或MphR(E)與特異雙鏈DNA序列的結(jié)合-解離作用，可以建立類似酶聯(lián)免疫法的類ELISA系統(tǒng)，以檢測(cè)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素物質(zhì)。這種系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是可檢測(cè)多種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。
　　目前已

2、有利用MphR(A)蛋白建立的體內(nèi)外檢測(cè)系統(tǒng)文獻(xiàn)報(bào)道，但尚無(wú)以MphR(E)蛋白建立的檢測(cè)系統(tǒng)報(bào)道。為了進(jìn)一步研究以調(diào)控蛋白-DNA相互作用為基礎(chǔ)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素檢測(cè)系統(tǒng)，本實(shí)驗(yàn)以類ELISA方法為手段，以MphR(A)及其DNA相互作用為模板，對(duì)比研究MphR(A)和MphR(E)蛋白及與蛋白相互作用的DNA序列。
　　本實(shí)驗(yàn)的基本路線是將合成的MphR(A)和 MphR(E)蛋白基因分別構(gòu)建到表達(dá)載體pET28b(+)，在大

3、腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)MphR(A)和MphR(E)蛋白，然后用純化蛋白建立大環(huán)內(nèi)酯類抗生素檢測(cè)的類ELISA系統(tǒng)。
　　本實(shí)驗(yàn)比較了MphR(A)和MphR(E)蛋白建立的類ELISA系統(tǒng)對(duì)各種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的識(shí)別特異性。結(jié)果表明，各種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在以MphR(A)和MphR(E)蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)中反應(yīng)特性一致。但在目前的反應(yīng)體系下，MphR(A)蛋白比MphR(E)蛋白性能更優(yōu)異。
　　本研究確認(rèn)MphR(A

4、)蛋白和MphR(E)蛋白不僅能夠和自身對(duì)應(yīng)的DNA序列結(jié)合，也可以和對(duì)方對(duì)應(yīng)的DNA序列結(jié)合，且兩個(gè)蛋白和DNA結(jié)合的特性接近。比較對(duì)應(yīng)三段DNA序列，發(fā)現(xiàn)三段DNA序列均含有一段22bp長(zhǎng)的不完全回文結(jié)構(gòu)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)基本確定這些不完全回文結(jié)構(gòu)為蛋白結(jié)合的核心序列。
　　采用不同的DNA序列構(gòu)建系統(tǒng)，系統(tǒng)靈敏度有差異。用A-DNA或B-DNA構(gòu)建系統(tǒng)的IC50為6.72±2.49 ng/mL（n=10），用C-DNA構(gòu)建系統(tǒng)的IC

5、50為3.95±1.18 ng/mL（n=10），而用AC4-DNA構(gòu)建系統(tǒng)的IC50為2.33±0.70 ng/mL（n=7）。B-DNA的不完全回文序列（B5-DNA）和C-DNA的不完全回文序列（C6-DNA）用作系統(tǒng)中反應(yīng)的DNA時(shí)，系統(tǒng)需要的蛋白濃度很高，而且系統(tǒng)背景值高，不合適目前體系下的類ELISA系統(tǒng)。根據(jù)類ELISA結(jié)果，推測(cè)蛋白和DNA的結(jié)合力對(duì)類ELISA系統(tǒng)靈敏度有影響，即在一定蛋白濃度范圍內(nèi)，蛋白和DNA結(jié)合力

6、越低，系統(tǒng)靈敏度越高。采用生物膜干涉技術(shù)（BLI）初步測(cè)定了A-DNA、B-DNA、C-DNA、AC4-DNA與MphR(A)蛋白的親和常數(shù)。結(jié)果表明A-DNA、B-DNA、AC4-DNA和蛋白的親和力接近，C-DNA和蛋白的親和常數(shù)較前三個(gè)DNA的低近一個(gè)數(shù)量級(jí)。
　　利用MphR(A)和A-DNA作基礎(chǔ)，采用蛋白和抗生素藥物分步反應(yīng)的方式，建立了原奶中紅霉素殘留的類ELISA系統(tǒng)。根據(jù)中國(guó)和歐盟殘留限量規(guī)定計(jì)算所得系統(tǒng)的CCα