青霉素類藥物殘留ELISA檢測方法研究.pdf

1、青霉素類藥物是一類重要的β-內(nèi)酰胺類抗生素，因其高效、低毒是目前獸醫(yī)學臨床上應用最受青睞的藥物之一。由于該類藥物的廣泛使用，使其在動物源性食品上的殘留現(xiàn)象越來越嚴重，雖然青霉素類藥物本身對機體沒有很強毒性，但容易引起藥物過敏反應，是各類過敏藥物之最；同時，若長期食用低濃度該類抗生素，會使細菌產(chǎn)生耐藥性，菌群失調(diào)，導致人體免疫力降低；此外，還給動物源性食品生產(chǎn)加工帶來不可估計的損失。因此，建立針對青霉素類藥物殘留的快檢測方法，開發(fā)價格適中

2、的試劑盒產(chǎn)品對控制動物源性食品衛(wèi)生質(zhì)量、保障消費者健康、保證工業(yè)生產(chǎn)等具有重要的社會經(jīng)濟意義。本研究對青霉素類藥物人工抗原的合成，動物免疫以及ELISA檢測方法的建立等進行了研究，得出如下研究結(jié)果： 選用半抗原氨芐青霉素、青霉素G與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)通過生理學法和戊二醛法合成3種免疫抗原，經(jīng)紫外、紅外掃描和蛋白電泳實驗證明半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功，繼而用相同方法與載體蛋白卵白蛋白(OVA)合成了3種包被抗原。

3、 用合成的3種免疫抗原免疫9只新西蘭大白兔，在6次加強免疫后有8只兔子產(chǎn)生高效價多抗血清；通過3種包被抗原進行多抗血清檢測，比較了各血清的效價和親和性，發(fā)現(xiàn)此兩種合成方法免疫兔子均能產(chǎn)生青霉素類藥物核特異性抗體，在本實驗中生理學法合成的免疫抗原免疫效果優(yōu)于戊二醛法合成法合成的，而同為生理學法合成的免疫抗原中，以氨芐青霉素為半抗原的免疫抗原效果略優(yōu)于青霉素G的；并且選出多抗血清具有效價高、親和性好、核特異性的免疫兔子脾臟，用液氮妥善保存，

4、提供給合作單位以便與其共同制備單克隆抗體。 在前面實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，從合作單位獲得與本實驗相符，通過生理學法免疫制備獲得的鼠單克隆抗體；同時，選擇相應的包被抗原通過改良的過碘酸鈉法與辣根過氧化物酶反應，用硫酸銨沉淀法純化，成功制備并獲得酶標抗原。利用鼠單抗、包被抗原、酶標二抗和鼠單抗、酶標抗原分別建立間接競爭ELISA檢測方法和直接競爭ELISA檢測方法；并對競爭性半抗原進行選擇性開環(huán)處理，以提高鼠單抗的親和性；比較上述兩種EL

5、ISA檢測方法的靈敏度、線性范圍、線性擬合以及檢測步驟、檢測時間等因素，發(fā)現(xiàn)直接競爭ELISA法靈敏度與間接競爭ELISA法相當，而直接ELISA法檢測更為簡便，較適合作為試劑盒產(chǎn)品的檢測方法。 本研究對直接ELLSA方法中的各檢測條件通過單因素顯著性分析和正交實驗進行了比較，并確定底物溶液配方為10mLBuffer+450μLTMB+2μLH2O2，封閉液為5％甘氨酸，鼠單抗和酶標抗原使用濃度分別為稀釋800倍和稀釋80倍，鼠

6、單抗包被條件為直接4℃冰箱放置過夜，封閉條件為37℃孵育2.5h，反應條件為37℃孵育1.0h，顯色條件為37℃反應10min，此時可達最佳顯色效果。用優(yōu)化后的直接競爭ELISA檢測方法測得青霉素類藥物最低檢測限，其中氨芐青霉素1.58ng/mL，青霉素G0.38ng/mL，阿莫西林1.90ng/mL，氯唑西林0.13ng/mL，苯唑西林0.44ng/mL，均能達到食品中各青霉素類藥物殘留檢測標準。 整個試劑盒實際檢測操作時間在

7、1.5h以內(nèi)；以青霉素G為對照物，通過多次重復實驗，取平均值，給出緩沖溶液條件下推薦的標準曲線，曲線方程為Y=0.327X+0.2419，X為log(青霉素濃度ng/mL)，Y為抑制率，最低檢測限0.368ng/mL，檢測范圍0.5～100ng/mL，尿樣和牛奶樣品稀釋10倍后檢測可參照此標準曲線，檢測樣品回收率在70～120％之間。由于青霉素類藥物在奶制品中殘留的嚴重現(xiàn)象，針對牛奶特殊樣品，用10％脫脂奶粉溶液做牛奶基質(zhì)，得到以牛奶為