巨大芽孢桿菌丙氨酸脫氫酶的復(fù)合物結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase，Ald，EC1.4.1.1)是一種以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（輔酶Ⅰ，NAD+）為輔酶的氨基酸脫氫酶，它能可逆催化丙氨酸氧化脫氨生成丙酮酸、氨及NADH。丙氨酸脫氫酶在生物體內(nèi)不僅能調(diào)節(jié)酮酸和氨基酸的穩(wěn)態(tài)平衡，還參與氨基酸代謝和糖代謝，且其催化反應(yīng)的產(chǎn)物丙酮酸在制藥、食品以及科學(xué)研究中有廣泛的用途。本研究主要介紹丙氨酸脫氫酶的表達(dá)、純化、結(jié)晶及酶空間結(jié)構(gòu)等方面。
　　以來源于巨

2、大芽孢桿菌中的丙氨酸脫氫酶為研究對(duì)象，把目的基因成功地構(gòu)建到載體pET-28a(+)上，獲得了pET-28a-ald重組質(zhì)粒，且其能在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功的表達(dá)。將重組蛋白進(jìn)行Ni2+柱親和層析的初步分離及純化和Resource Q柱的進(jìn)一步純化，得到較純的重組蛋白，為下一步蛋白質(zhì)結(jié)晶提供了有利的條件。
　　通過蛋白質(zhì)結(jié)晶條件Crystal ScreenⅠ&Ⅱ，IndexⅠ&Ⅱ和PEG/IonⅠ&Ⅱ?qū)尉Ш蛷?fù)合物共晶的結(jié)晶條件進(jìn)

3、行初步篩選，以初篩條件中晶體生長(zhǎng)較好的條件為基礎(chǔ)進(jìn)行條件優(yōu)化，最終獲得高質(zhì)量的塊狀或四方體的單晶和復(fù)合物共晶。用X射線衍射法對(duì)晶體數(shù)據(jù)進(jìn)行收集，得到了單晶衍射率為2.97(A)，二元共晶衍射率為2.88(A)和三元共晶衍射率為2.67(A)。Ald單晶和二元共晶所屬的空間群均為R32，三元共晶所屬的空間群為P2。通過SFCHECK軟件對(duì)收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)分析，我們發(fā)現(xiàn)單晶和二元共晶的晶體結(jié)構(gòu)中每個(gè)不對(duì)稱單位中含有1個(gè)蛋白質(zhì)分子。Al