一株產(chǎn)苯丙氨酸脫氫酶菌株的分離鑒定、產(chǎn)酶條件及其酶特性的研究.pdf

1、苯丙氨酸脫氫酶(Phenylalaninedehydrogenase，EC1.4.1.20，簡(jiǎn)稱(chēng)PheDH)是臨床苯丙酮尿癥的檢測(cè)用酶。國(guó)外已有檢測(cè)苯丙酮尿癥的酶試劑盒出售，國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)該酶產(chǎn)品。 本研究從土壤中分離篩選到一株產(chǎn)苯丙氨酸脫氫酶的菌株X5-3，對(duì)其進(jìn)行鑒定，并進(jìn)一步研究了該菌株的產(chǎn)酶發(fā)酵條件、酶的初步純化及該酶的性質(zhì)。主要試驗(yàn)結(jié)果如下： 1.產(chǎn)酶菌株的分離、篩選和鑒定經(jīng)過(guò)以苯丙氨酸為主要碳氮源的培養(yǎng)基的富集

2、、純化后，得到5株菌，通過(guò)酶活性測(cè)定，確定菌株X5-3為本研究的最佳產(chǎn)酶菌株。通過(guò)對(duì)該菌株的形態(tài)學(xué)、生理生化特性鑒定，G+Cmol％含量測(cè)定，16SrDNA測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定菌株X5-3屬于無(wú)色桿菌(Achromobactersp.)。 2.菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的各個(gè)條件，采用搖瓶震蕩培養(yǎng)，以測(cè)定酶活為主要指標(biāo)，確定了該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基組成為：谷氨酸鈉，18.0g；葡萄糖，18.0g；L-Phe，5.0

3、g；NaCl，2.0g；K2HPO4·3H2O，2.0g；KH2PO4，2.0g；MgSO4·7H2O，0.1g；酵母膏，0.1g；水，1000ml；pH7.0。最適培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度30℃，裝液量為100ml三角瓶裝25ml培養(yǎng)基，于150rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)48h。在上述培養(yǎng)條件下發(fā)酵，發(fā)酵液的酶活可達(dá)0.25U/ml。 3.酶的純化和性質(zhì)在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，收集的細(xì)胞經(jīng)高壓破碎后制成粗酶液，再經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-S

4、epharoese離子交換層析、ToyopearlHW-65C疏水層析、SephadexG-100分子篩層析后，提純了約268倍，比活達(dá)到12.04U/mg。根據(jù)凝膠層析G-100粗略估計(jì)出該苯丙氨酸脫氫酶的分子量在150,000Da左右，純化后的酶經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，顯示為三條帶，其分子量分別為66,200Da、55,000Da和43,000Da。這三條帶是否都是該苯丙氨酸脫氫酶的亞基還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。對(duì)苯丙氨酸脫氫酶的理化