基于質(zhì)譜的生物標(biāo)志物檢測方法研究與應(yīng)用.pdf

1、質(zhì)譜技術(shù)具有靈敏度高、準(zhǔn)確性高和易操作等優(yōu)點(diǎn)，適用于復(fù)雜體系中微量或痕量物質(zhì)的檢測或結(jié)構(gòu)鑒定等。生物質(zhì)譜檢測中常用的儀器包括基于電噴霧的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(HPLC-EIS-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，廣泛的應(yīng)用于蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物活性分子的研究。但基于LC-ESI-MS的質(zhì)譜檢測研究通常耗時(shí)較長，基于MALDI-TOF MS的研究雖然耗時(shí)短但前處理復(fù)雜，樣品轉(zhuǎn)移通量較低且質(zhì)譜快速檢測研究中尚且缺乏一種基于MALD

2、I-TOF MS的定量檢測的方法，只能對樣品進(jìn)行有限的定性研究。針對生物質(zhì)譜分析技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中存在的問題，論文重點(diǎn)開展了三個(gè)方面的研究:
　　(1)探索了一種基于特征多肽進(jìn)行肉類動(dòng)物溯源的方法。以市場常見易混肉（雞、豬、牛、羊、鴨肉）為實(shí)驗(yàn)對象，經(jīng)過一定的前處理，提取肉中的肌紅蛋白，利用MALDI-TOF和LC-MS等設(shè)備對其進(jìn)行鑒別檢測。通過對提取出的肌紅蛋白進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析得出五種肌紅蛋白的差異，利用LC-MS

3、多肽序列標(biāo)簽技術(shù)比較不同動(dòng)物肉的酶解產(chǎn)物中多肽序列信息，由特征多肽可以確定肉類來源，如我們通過在酶解后的混合樣品中對牛肌紅蛋白中特征多肽HPSDFGADAQAAMSK的分析結(jié)果可以表明混合樣品中含有牛肉，依此方法得出混合樣品中含有的其他樣品。實(shí)驗(yàn)證實(shí)利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)識(shí)別不同肉的來源的可行性，結(jié)果表明五種易混肉酶解產(chǎn)物中分別存在特征多肽，這些多肽可用于肉類溯源性分析，從而建立了一種基于MALDI-TOF和HPLC-MS的肉類溯源性檢測鑒別

4、方法。
　　(2)建立了一種基于MALDI-TOF MS的生物標(biāo)志物定量檢測的方法，以腦鈉尿肽(BNP)和血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ)為標(biāo)志物，以B型腦鈉尿肽的同源物質(zhì)BNP+K以及血管緊張素Ⅱ衍生物為內(nèi)標(biāo)，研究了兩種標(biāo)志物的定量檢測方法。B型腦鈉尿肽(BNP)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在兩種物質(zhì)濃度比為1～100范圍內(nèi)BNP和BNP+K的信號(hào)強(qiáng)度與濃度呈良好的線性關(guān)系，R2=0.9989，在此基礎(chǔ)上建立了目標(biāo)樣品的定量檢測方法，

5、特別是對于生物標(biāo)志物的檢測。血管緊張素Ⅱ的實(shí)驗(yàn)中采用與上述同樣的方法，結(jié)果兩種物質(zhì)的的標(biāo)準(zhǔn)曲線為R2=0.9936，呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，證明了基于MALDI-TOFMS的血管緊張素Ⅱ的定量檢測可行，并將方法拓展到其他生物標(biāo)志物的定量檢測。
　　(3)建立了一種基于表面修飾和蛋白質(zhì)偶聯(lián)的微層析柱制備方法。采用基于魔芋葡甘聚糖的親和層析介質(zhì)以及毛細(xì)管內(nèi)壁硅烷化衍生氨基的研究方法，建立了一種用于MALDI-TOF MS樣品預(yù)處理的毛細(xì)管

6、親和層析柱的制備方法。首先采用硫酸和雙氧水氧化法將羥基引入到石英毛細(xì)管內(nèi)表面，進(jìn)一步使用氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)對毛細(xì)管進(jìn)行修飾以將氨基偶聯(lián)到毛細(xì)管內(nèi)表面;采用1，4-丁二醇二縮水甘油醚(BDGE)將魔芋葡甘聚糖(KGM)進(jìn)行活化，將活化后的KGM與毛細(xì)管上的氨基進(jìn)行了偶聯(lián)，在此基礎(chǔ)上將模型蛋白（胰蛋白酶）偶聯(lián)到毛細(xì)管內(nèi)KGM，成功制備出毛細(xì)管親和層析柱，考察了KGM和環(huán)氧基含量對模型蛋白偶聯(lián)量及其樣品預(yù)處理效果的影響。結(jié)果表

7、明，KGM分子量是影響毛細(xì)管層析柱上蛋白偶聯(lián)量的關(guān)鍵因素，以胰蛋白酶抑制劑為目標(biāo)物結(jié)合MALDI-TOF MS對親和層析柱的分離效果進(jìn)行了評價(jià)，證明了偶聯(lián)胰蛋白酶的毛細(xì)管層析柱可有效實(shí)現(xiàn)胰蛋白酶抑制劑的分離和濃縮?；诒砻嫣幚砗蚄GM衍生的毛細(xì)管親和層析柱制備技術(shù)可用于MALDI-TOF MS分析的樣品預(yù)處理。
　　本文中建立的基于LC-MS的樣品溯源檢測方法和基于MALDI-TOF MS的生物標(biāo)志物的定量檢測的方法為生物質(zhì)譜技術(shù)