鼠李糖脂高產(chǎn)菌株誘變篩選、遺傳改造及關(guān)鍵酶的異源表達(dá).pdf

1、隨著世界經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展，能源的供給與需求矛盾日益突出，特別是作為工業(yè)“命脈”的石油，因原油貯量的日益減少帶來了嚴(yán)重的能源危機(jī)。目前我國以常規(guī)技術(shù)，原油采出率僅有30％左右，大量的石油尤其是高粘、高凝和高含臘油滯留在儲(chǔ)油層。尋求高效和廉價(jià)的采油新技術(shù)一直是研究的熱點(diǎn)。微生物提高原油采收率(MEOR)能大幅度提高石油采出率，被認(rèn)為是當(dāng)前開采枯竭油藏和油藏剩余油的最好技術(shù)，對(duì)于充分利用現(xiàn)有的油藏資源具有重大意義。另外，在石油的開采、運(yùn)輸與使用過

2、程中，有時(shí)會(huì)發(fā)生石油外泄事故或不當(dāng)排放，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。因具有應(yīng)用范圍廣、操作簡(jiǎn)便、效果明顯、成本低、不造成二次污染等優(yōu)點(diǎn)，烴降解微生物是公認(rèn)的最有效最徹底解決復(fù)雜烴類污染的手段。
　　 從廣義上講，MEOR主要有三種不同方法策略:(1)生物表面活性劑在異地反應(yīng)器生產(chǎn)，隨后加入到貯油腔進(jìn)行驅(qū)油;(2)直接向油藏中注入外來微生物，在油藏中生長(zhǎng)繁殖，代謝產(chǎn)生促進(jìn)原油流動(dòng)的表面活性劑;(3)將營養(yǎng)物質(zhì)注入油井中，刺激土著菌在油井內(nèi)

3、生產(chǎn)表面活性劑。生物表面活性劑廣泛應(yīng)用于微生物提高石油采收率和烴類污染物環(huán)境修復(fù)的領(lǐng)域中，其中效果最好、研究最多的就是鼠李糖脂。而阻礙鼠李糖脂成為MEOR主力軍的原因主要有:成本高，產(chǎn)量過低;主要生產(chǎn)菌——銅綠假單胞菌是一種對(duì)人體有害的條件致病菌，不能應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)中。針對(duì)上述鼠李糖脂在實(shí)際應(yīng)用中的一些問題，本論文從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究:
　　 1.誘變篩選銅綠假單胞菌高產(chǎn)鼠李糖脂菌株
　　 通過紫外誘變、硫酸二

4、乙酯(DES)、等離子體和復(fù)合誘變等方法對(duì)銅綠假單胞菌SH6(1.2 g/L)進(jìn)行了誘變育種，篩選高產(chǎn)菌株。經(jīng)過多輪誘變后，篩選到一株高產(chǎn)突變株P(guān)ZA(1)，最高鼠李糖脂產(chǎn)量4.0 g/L，再經(jīng)過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的配方，使PZA(1)的最高鼠李糖脂產(chǎn)量達(dá)到6.7 g/L且遺傳穩(wěn)定，比原始菌株提高了近5倍。
　　 2.多拷貝復(fù)制啟動(dòng)子，構(gòu)建銅綠假單胞菌高產(chǎn)鼠李糖脂工程菌
　　 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，真菌如瑞氏木霉和黑曲霉的多拷

5、貝啟動(dòng)子能夠提高目的基因的表達(dá)量。將鼠李糖脂合成的關(guān)鍵酶——鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子序列中的功能區(qū)域，即318～479 bp，進(jìn)行1、3、5拷貝的復(fù)制，并將之轉(zhuǎn)化在銅綠假單胞菌中，分別構(gòu)建了P.aeruginosa1P，P.aeruginosa3P，P.aeruginosa5P菌株。通過提高鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量，進(jìn)而提高鼠李糖脂產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多拷貝啟動(dòng)子能夠提高銅綠假單胞菌的鼠李糖脂產(chǎn)量，其中3拷貝啟動(dòng)子菌株的鼠李糖脂產(chǎn)量達(dá)到1.6

6、 g/L，比野生株產(chǎn)量提高了30％;5拷貝啟動(dòng)子菌株的鼠李糖脂產(chǎn)量達(dá)到1.7 g/L，比野生株產(chǎn)量提高了40％，效果顯著。
　　 3.敲除PHA的合成基因，構(gòu)建銅綠假單胞菌高產(chǎn)鼠李糖脂工程菌
　　 經(jīng)檢測(cè)，銅綠假單胞菌SH6既能產(chǎn)生鼠李糖脂，還能產(chǎn)生聚羥基烷酸酯(PHA)，而兩者的代謝途徑共用β-羥基脂肪酸為合成底物，所以通過敲除PHA的合成基因以阻斷銅綠假單胞菌SH6中PHA的合成途徑而使鼠李糖脂的合成獲得更多的底物，

7、繼而提高其產(chǎn)量。用三親雜交的方法分別敲除了PHA合成基因phaC和phaG，其中敲除株△phaG的PHA含量明顯降低，其鼠李糖脂產(chǎn)量也比原始菌株提高了40％，產(chǎn)量達(dá)到1.7 g/L，但敲除phaC后效果甚微。
　　 4.鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶在油井內(nèi)嗜熱菌中的異源表達(dá)
　　 通過形態(tài)觀察和分子生物學(xué)方法鑒定了兩株篩選自油井內(nèi)的嗜熱菌株，鑒定結(jié)果為兩株篩均屬于Geobacillus屬。根據(jù)Geobacillus屬的研究報(bào)道，選擇p