M型磷脂酶A2受體抗體高靈敏定量方法的研制及在膜性腎病診斷中的應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　建立抗PLA2R抗體的超靈敏定量檢測方法，改進(jìn)抗PLA2R抗體檢測在特發(fā)性膜性腎病、繼發(fā)性膜性腎病乃至其他腎病中的應(yīng)用。
　　內(nèi)容:
　　(1)重組PLA2R的表達(dá)、純化和鑒定。
　　(2)抗PLA2R抗體的定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備。
　　(3) Eu3+標(biāo)記抗人IgG抗體的制備。
　　(4)建立抗PLA2R抗體時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）檢測方法，并進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化選擇和方法學(xué)的評(píng)估。<

2、br>　　(5)將此技術(shù)應(yīng)用于膜性腎病的研究，是否可以準(zhǔn)確的評(píng)估抗PLA2R抗體在特發(fā)性膜性腎病、繼發(fā)性膜性腎病乃至其他腎病中的應(yīng)用價(jià)值，是否可能通過不同的閾值對(duì)膜性腎病的程度和類型進(jìn)行區(qū)分。
　　方法:
　　(1)采用帶有flag標(biāo)簽的PLA2R質(zhì)粒進(jìn)行重組PLA2R的表達(dá)、用偶聯(lián)有flag抗體的柱料進(jìn)行純化、鑒定重組PLA2R的分子量和免疫反應(yīng)活性。
　　(2)篩選出一個(gè)含高濃度抗PLA2R抗體的血清，采用尿素解離

3、結(jié)合在PLA2R包被孔上的抗PLA2R抗體，并進(jìn)行IgG抗體定量，推算出原血清中抗PLA2R抗體的濃度，將此已知抗PLA2R抗體濃度的樣品稀釋到不同濃度作為抗PLA2R抗體的標(biāo)準(zhǔn)品。
　　(3)建立抗PLA2R抗體TRFIA檢測方法，并從包被濃度的選擇、標(biāo)記抗體稀釋度的選擇、血清稀釋度的選擇、反應(yīng)時(shí)間的選擇等各方面進(jìn)行了優(yōu)化。從批內(nèi)批間精密度、靈敏度、回收率、測量范圍等方面對(duì)建立的TRFIA方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　(4)用建立的

4、TRFIA試劑盒檢測167腎病患者（其中特發(fā)性模性腎病77例，IgA腎病53例，紅斑狼瘡腎病16例，其它腎病21例）血清及286例健康體檢者血清中PLA2R自身抗體濃度，進(jìn)行參考范圍的建立和診斷價(jià)值分析。
　　創(chuàng)新性成果:
　　(1)制備了具有特異性免疫反應(yīng)活性的重組PLA2R抗原，可用于抗PLA2R抗體的檢測。
　　(2)制備了抗PLA2R抗體標(biāo)準(zhǔn)品，為抗PLA2R抗體檢測的量化提供了依據(jù)。設(shè)置的抗PLA2R抗體的標(biāo)

5、準(zhǔn)品濃度分別為0μg/ml、0.17μg/ml、0.68μg/ml、3.42μg/ml、17.1μg/ml、68.4μg/ml、343μg/ml。
　　(3)目前抗PLA2R抗體的血清學(xué)檢測尚處于理論研究階段，主要采用western-blot方法，少數(shù)研究者采用間接免疫熒光法和ELISA方法，但這些方法靈敏度有限，主要用于定性或半定量分析，而且操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，另外目前還沒有商品化的抗PLA2R抗體的定量檢測試劑盒。本研究建立的TRF

6、IA方法檢測抗PLA2R抗體具有良好的檢測性能，其靈敏度為0.02μg/ml，檢測上限為343μg/ml，有效檢測范圍為0.02μg/mL～343μg/ml，3份標(biāo)本的回收率均值為98.96％，批內(nèi)CV％(n=20)分別為6.38％、5.55％、4.88％，批間(n=8)CV％分別為7.69％、6.23％、6％，均＜10％。本研究意義在于為膜性腎病患者提供一個(gè)除穿刺以外的可臨床實(shí)際應(yīng)用的血清學(xué)診斷指標(biāo)，為該病的診斷、活動(dòng)性的判斷、治療時(shí)

7、機(jī)的把握、藥物的選擇及療效判斷提供一個(gè)理想的血清學(xué)標(biāo)志物。使該病情的診斷和監(jiān)控更為方便，患者容易接受，有利于特發(fā)性膜性腎病的早期診斷和治療。
　　(4)通過設(shè)定不同的閾值可以將正常人、IgA腎病、紅斑狼瘡腎病、IMN、其它腎病進(jìn)行區(qū)分，0～0.91μg/ml為正常參考值，35.8％的IgA腎病、50％的紅斑狼瘡腎病、14.3％其它腎病、88.3％的IMN的抗PLA2R抗體的值＞0.91μg/ml，IMN的檢測特異性為90.9％;若