人神經(jīng)元特異性烯醇化酶的基因克隆及單克隆抗體的制備和鑒定.pdf

1、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)是烯醇化酶的一種同工酶.γγ、αγ組成的同工酶為神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特有,故命名為神經(jīng)元特異性烯醇化酶.NSE基因核苷酸序列全長2423bp,開放讀碼框架從第226到1531個(gè)堿基,長度為1305bp,編碼全部434個(gè)氨基酸.目的本研究的目的是通過克隆序列正確的人神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)基因,表達(dá)蛋白,制備出鼠抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的單克隆

2、抗體,以便為檢測腫瘤細(xì)胞或組織中NSE抗原提供一種有效的工具.方法首先利用NSE特異引物,通過RT-PCR從人肺癌細(xì)胞株A549中擴(kuò)增人NSE分子的cDNA全長.與pGEM-T載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-T-NSE.重組質(zhì)粒測序鑒定基因序列,然后將NSE基因定向克隆于原核高效表達(dá)載體pMS-31b,轉(zhuǎn)化大腸桿菌POP21 36經(jīng)42℃熱誘導(dǎo)獲得MS2-NSE融合蛋白.融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、電洗脫、

3、PBS透析純化后,免疫BALB/C小鼠.應(yīng)用常規(guī)雜交瘤技術(shù),通過ELISA雙篩,篩出能分泌抗人NSE單克隆抗體(NSE McAb)的雜交瘤細(xì)胞株并進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)制備腹水.檢測其分泌抗體的亞型,據(jù)亞型選擇不同的純化方法純化.然后用細(xì)胞化學(xué)、特異性、Western-blot等方法鑒定制備抗體的免疫反應(yīng)及特異性.以自制的NSE McAb采用IHC技術(shù)檢測NSE在人肺癌細(xì)胞A549、BE1(高轉(zhuǎn)移)、LH7(低轉(zhuǎn)移)以及肝癌細(xì)胞7402中的表達(dá).

4、結(jié)果本研究克隆了人神經(jīng)元特異性烯醇化酶基因,測序結(jié)果證明克隆的NSE基因序列完全正確,獲得了2株能穩(wěn)定分泌抗NSE單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,制備了抗NSE的單克隆抗體,經(jīng)檢測其分泌抗體的亞型分別為IgG1和IgG2a.細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明NSE在肺癌細(xì)胞A549、BE1(高轉(zhuǎn)移)、LH7(低轉(zhuǎn)移)以及肝癌細(xì)胞7402中均表達(dá)于胞漿.結(jié)論本研究制備了抗NSE單克隆抗體,初步檢測了NSE在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況,為以后進(jìn)一步研究NSE的功能奠定了