抗大片吸蟲分泌排泄抗原單克隆抗體的制備及生物學(xué)活性的鑒定.pdf

1、大片吸蟲（Fasciolagigantica）是一種危害反芻動(dòng)物健康的常見寄生蟲，嚴(yán)重影響動(dòng)物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，給農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)都帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立一種快速診斷大片吸蟲的免疫學(xué)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 本研究利用雜交瘤技術(shù)，以大片吸蟲分泌排泄抗原作為免疫原，用建立的間接ELISA法進(jìn)行篩選，制備了5株抗大片吸蟲分泌排泄抗原單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為6D3、6B4、7D1、7D2、7D4。經(jīng)鑒定5株雜交瘤細(xì)

2、胞染色體計(jì)數(shù)為90～110條，均大于親本細(xì)胞，其亞類鑒定分別屬于IgG2b，IgM，IgG1，IgM和IgM，5株單抗的輕鏈均為k型；經(jīng)測(cè)定5株單抗上清效價(jià)分別為1：400、1：3200、1:6400、1：25600、1：6400，腹水效價(jià)分別為1:104、1:104、1:107、1:105、1：106;表位測(cè)定表明這五株McAb中，6D3與7D1、7D2，7D4與7D1、7D2作用于不同的表位，6D3與6B4可能識(shí)別同一表位或重疊表位

3、，或同一表位有空間位阻，7D4與6D3，6B4與7D4、7D1、7D2可能具有空間位阻；5株單抗的相對(duì)親和力為6B4>7D4>7D1>6D3>7D2;對(duì)傳代細(xì)胞株和凍存復(fù)蘇細(xì)胞株的測(cè)定表明，5株雜交瘤細(xì)胞株均能穩(wěn)定地分泌單克隆抗體。
　　 用單克隆抗體7D1包被ELISA板，用大片吸蟲分泌排泄抗原免疫家兔，按常規(guī)方法制備兔多克隆抗體作為第二抗體，建立了檢測(cè)大片吸蟲分泌排泄抗原的雙抗體夾心ELISA方法，結(jié)果表明，該雙抗體夾心EL

4、ISA的最佳反應(yīng)條件為：?jiǎn)慰寺】贵w7D1包被濃度為12.282ug/mL，兔抗牛多克隆抗體最佳稀釋倍數(shù)為1：10000，酶標(biāo)抗體工作濃度為l：8000，最佳封閉液為10％的脫脂奶粉，血清作用時(shí)間為lh，多克隆抗體作用時(shí)間為lh，酶標(biāo)二抗作用時(shí)間為45min，底物顯色時(shí)間為20min，酶標(biāo)抗體以0D450nm≥0.130作為陰陽臨界值。用該ELISA方法分別檢測(cè)胰闊盤吸蟲ES抗原、前后盤吸蟲ES抗原、伊氏錐蟲VSG抗原、弓形蟲IHA抗原、

5、旋毛蟲和泰勒蟲抗原。結(jié)果表明，該ELISA方法與以上病原均無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的最低檢測(cè)下限為55.93ng/mL。同時(shí)檢測(cè)247份臨床樣品，抗原檢出率為23.89％。
　　 本研究成功制備了五株穩(wěn)定分泌抗大片吸蟲分泌排泄抗原的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系，建立了間接ELISA方法和雙抗體夾心ELISA方法，并對(duì)臨床血清樣品的大片吸蟲循環(huán)抗原進(jìn)行了檢測(cè)，這些研究成果為大片吸蟲病的免疫診斷、防治等的進(jìn)