Neuropilin-1單克隆抗體的制備及初步鑒定.pdf

1、Neuropilins(NRPs)是一個(gè)新型的多功能受體，通過(guò)與3型semaphorins的結(jié)合，能夠介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，同時(shí)，通過(guò)與VEGF(vascular endothelialgrowth factor)家族的結(jié)合，介導(dǎo)血管的生成。NRPs家族包括NRP-1和NRP-22個(gè)成員，其中NRP-1在神經(jīng)和心血管的發(fā)育中起到了關(guān)鍵性的作用；而NRP-2則在神經(jīng)和淋巴管的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮作用。更重要的是，NRPs高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面，

2、并參與腫瘤的生長(zhǎng)和腫瘤血管的生成。研究顯示，阻斷NRP-1與VEGF的結(jié)合，既能直接抑制腫瘤的生長(zhǎng)，也能通過(guò)抑制腫瘤血管的生成間接抑制腫瘤生長(zhǎng)。因此，NRP-1被認(rèn)為是繼VEGF后又一重要的，也是最有希望的抗腫瘤新靶標(biāo)。本文通過(guò)基因工程技術(shù)獲取了NRP-1 b1b2結(jié)構(gòu)域的基因序列并表達(dá)蛋白，繼而利用雜交瘤技術(shù)獲得特異性針對(duì)此結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體。
　　 我們利用RT-PCR技術(shù)獲取NRP-1 b1b2結(jié)構(gòu)域的基因，并將其克隆至質(zhì)

3、粒pET22b(+)，獲得原核表達(dá)載體NRP-1 b1b2-pET22b(+)；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)劑量和誘導(dǎo)時(shí)間，確定目的蛋白的高效表達(dá)條件。鎳親和層析柱和HPLC純化目的蛋白，并采用尿素梯度復(fù)性緩沖液透析復(fù)性。以復(fù)性蛋白免疫小鼠，取其脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)過(guò)多次克隆篩選，獲得NRP-1 b1b2單克隆抗體克隆細(xì)胞株，繼而腹水生產(chǎn)并純化抗體。ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定抗體的亞型和滴度

4、；Western blot、免疫共沉淀和熒光免疫組化實(shí)驗(yàn)鑒定抗體的特異性；DNAstar軟件和DiscTope軟件對(duì)NRP-1b1b2的表位進(jìn)行預(yù)測(cè)并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA和免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)果表明，我們獲得序列正確的重組質(zhì)粒NRP-1 b1b2-pET22b(+)，其在E.coli Rosetta中主要以包涵體的形式高效表達(dá)；通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，確定在終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)條件下，最適誘導(dǎo)

5、時(shí)間為4 h；經(jīng)過(guò)2次融合，共篩選1500株雜交瘤細(xì)胞，獲得57株陽(yáng)性株，選取其中滴度最高的1株進(jìn)行抗體的腹水生產(chǎn)；ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示純化抗體的亞型為IgG1，且滴度達(dá)到了1:32000； Western b1ot、免疫共沉淀和熒光免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗體不僅能夠正確識(shí)別NRP-1b1b2融合蛋白，同時(shí)也能正確識(shí)別生理狀態(tài)下全長(zhǎng)的NRP-1；NRP-1b1b2多肽片段的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA和免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗體與含線(xiàn)性抗原表位的NR