海洋生物內(nèi)生真菌的分離及抗老年癡呆活性成分研究.pdf

1、老年癡呆癥中最常見的為阿爾茨海默病(Alzheimerdisease，AD)，它嚴重影響了患者的認知功能、記憶功能、個人及社會生活能力等。目前，關于AD病理較為接受的為“膽堿能缺失學說”，認為大腦內(nèi)神經(jīng)遞質—乙酰膽堿的缺失是導致AD的關鍵原因，故對AD的治療主要是采用乙酰膽堿酯酶抑制劑，如他克林、加蘭他敏、石杉堿甲等，通過抑制乙酰膽堿脂酶，提高患者體內(nèi)的乙酰膽堿水平，延緩乙酰膽堿的水解速度，發(fā)揮治療作用。但目前的藥物價格較貴，且具有一定

2、的副作用，化學合成新的藥物難度大，故天然產(chǎn)物藥物的開發(fā)與研究成為研究的重點。海洋微生物生活環(huán)境較為特殊，代謝途徑獨特，因而具有多種生物活性。因此，本文采集海洋野生的動植物，分離其內(nèi)生真菌，以乙酰膽堿酯酶的抑制率為指標，進行活性菌株的篩選及鑒定，優(yōu)化液體發(fā)酵條件，并分離發(fā)酵液中的活性次生代謝產(chǎn)物，采用波譜學的方法分析鑒定其結構。本文研究的內(nèi)容及結果如下:
　　 1.海洋生物內(nèi)生真菌的分離及抗老年癡呆活性菌株篩選、鑒定
　　

3、 以長島海域9種海洋動物、植物為原材料，對其內(nèi)生真菌進行分離、純化，分離出的內(nèi)生真菌進行液體發(fā)酵，并采用DTNB顯色法測定各菌種發(fā)酵液抑制乙酰膽堿酯酶活性，篩選具有活性的菌株，并對其中活性最高的一株菌株Pt-2進行形態(tài)學和分子生物學的鑒定，確定菌株種屬。
　　 實驗結果表明，從長島海域采集到的9種生物中分離獲得內(nèi)生真菌42株，具有抑制乙酰膽堿酯酶活性的33株，其中Pt-2菌株的發(fā)酵液活性最高，抑制率為65.12％。該菌種經(jīng)鑒定為

4、芽枝霉屬，命名為Cladosporiumsp.Pt-2。
　　 2.Cladosporiumsp.Pt-2菌株液體發(fā)酵條件的優(yōu)化
　　 以發(fā)酵液AchE抑制率為活性指標，采用單因素和正交試驗對發(fā)酵時間、接種量、裝液量、培養(yǎng)溫度和碳源、氮源等發(fā)酵條件進行優(yōu)化。最終得出其最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間9天、接種量5％、裝液量200mL（每500mL三角瓶）、培養(yǎng)溫度25℃，碳源為葡萄糖，氮源為酵母膏。在此條件下，發(fā)酵液提取物的乙酰膽

5、堿酯酶抑制率較高，為76.32％。
　　 3.Cladosporiumsp.Pt-2發(fā)酵液中抑制AchE活性物質的分離
　　 發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取后，采用硅膠柱層析、反相柱層析、凝膠柱和高效液相等色譜學的方法進行分離，分離得到組分1、2和3，通過波譜學的方法進行結構測定。最終化合物1確定為環(huán)（纈-亮）二肽，化合物2確定為環(huán)（酪-亮）二肽，組分3經(jīng)GC-MS分析可能含有5個化合物，分別為3-1甲基睪酮，3-2二苯硫醚，3-