枸骨內(nèi)生真菌抗菌活性成分的分離、鑒定及應用研究.pdf

1、本論文通過系統(tǒng)篩選，從植物枸骨（Llex cornuta Lindl.）中分離到的一株具有高抗菌活性的內(nèi)生真菌，并以此作為研究對象，對該內(nèi)生真菌進行了種屬鑒定，并對其代謝產(chǎn)物中主要活性成分進行了提取、分離和結構解析；在此基礎上研究了主要活性成分的分析檢測方法和抑菌作用，通過紫外誘變選育出高效活性生產(chǎn)菌株，運用隨機擴展多態(tài)性DNA（RAPD）技術對該菌及其誘變體進行DNA多態(tài)性分析，最后對活性成分的安全性和藥效進行了評價。主要研究結果如下

2、：
　?。?）枸骨內(nèi)生真菌的屬種鑒定：根據(jù)形態(tài)培養(yǎng)特征和生理生化特征，對照《真菌鑒定手冊》將該內(nèi)生真菌初步歸屬為木霉屬真菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum Rifai），將其命名為哈茨木霉菌株L。
　　（2）哈茨木霉菌株L的代謝產(chǎn)物的主要抗菌活性成分：分離純化得到哈茨木霉菌株L代謝產(chǎn)物的主要抗菌活性成分，經(jīng)IR、MS和NMR光譜分析確定為一倍半萜類化合物，英文名稱為：trichodermin，化學名稱：4

3、β-乙酰基-12，13-環(huán)氧-9-單端孢霉烯。并且建立了該物質的氣相色譜分析方法。
　?。?）活性物質trichodermin的抑菌活性：室內(nèi)毒力測定結果表明，Trichodermin對9種植物病原真菌的菌絲生長和2種植物病原真菌孢子的萌發(fā)均有不同程度的抑制作用。其中對水稻紋枯病菌[Thanatephorus cucumeris（Frank）Donk]和黃瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani Küehn）有較好的毒力，

4、其 EC50值分別為0.7071μg/mL和0.3253μg/mL；對番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers）和番茄早疫病[Alternaria solani（Ellis et Martin） Jones et Grout.]，毒力作用次之，其EC50值分別為3.7287μg/mL和10.6772μg/mL；對黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum Owen）、西瓜枯萎病菌

5、（Fusarium oxysporium f.sp.niveum）、菜豆炭疽病菌[Colletotrichum lindemuthianum（sacc. et Magn.）Br. et Cav.]和葡萄炭疽病菌[Colletotrichum gloeosporioides（Penz.）Sacc.]的毒力相對較弱，其EC50值分別為23.4072、41.6013、33.0261和28.6393μg/mL；對水稻胡麻斑病菌[Cochliob

6、olus miyabeanus（Ito&Kuribayashi）]的毒力最差（>800μg/mL）。對黃瓜枯萎病菌（F. oxysporum f.sp.cucumerinum）和西瓜枯萎病菌（F.oxysporium f.sp.niveum）孢子萌發(fā)的抑制作用EC50分別為2.2209和2.2905μg/mL。活體試驗結果表明，Trichodermin濃度為100mg/L時，對番茄早疫病（A.solani）及黃瓜立枯?。≧..solan

7、i）的保護效果達97.8％和98.1%，治療效果達96.7%和97.3%。
　?。?）Trichodermin制劑的藥效、安全性及毒理學研究：盆栽試驗結果表明，Trichodermin1000倍液對黃瓜立枯病（R..solani）有良好的治療和保護作用，7天后保護防效和治療防效分別為88.89%和95.83%； Trichodermin在番茄及土壤中降解較快，殘留極低，施藥后的第10天trichodermin在番茄中的殘留量僅0.

8、0054mg/kg，在土壤中的殘留量僅為0.0013mg/kg；經(jīng)毒理學研究發(fā)現(xiàn)，Trichodermin原藥產(chǎn)品對哺乳類動物十分安全，按 GB15670-1995《農(nóng)藥登記毒理學試驗方法》的分級標準該農(nóng)藥的原藥屬低毒。
　　（5）高效菌株的選育及誘變前后菌株RAPD分析：以哈茨木霉菌株L作為出發(fā)菌株，進行紫外線二次復合誘變處理，通過初篩和復篩，獲得一株高產(chǎn)突變株 UV-5-3，其產(chǎn)素水平為164.75μg/mL，是原始菌株2.3

9、倍。傳代試驗表明，該突變株的高產(chǎn)性能遺傳特性較穩(wěn)定。運用RAPD技術對哈茨木霉菌株L及相應誘變體進行DNA多態(tài)性分析，12條隨機引物共擴增出106條譜帶，多態(tài)性標記數(shù)為58條，占擴增總帶數(shù)的54.7%。DNA片段大小范圍在300~5000bp內(nèi)，大多數(shù)集中在600~2000bp。利用NTSYS統(tǒng)計軟件對擴增結果進行統(tǒng)計和聚類，結果表明，哈茨木霉菌株 L誘變前后具有一定的遺傳穩(wěn)定性和遺傳多態(tài)性，但供試菌株的RAPD分析與其生防效果之間不存