雞卵黃免疫球蛋白的糖基化與功能特性的機制規(guī)律研究.pdf

1、雞卵黃免疫球蛋白，簡稱IgY(chicken eggyolk immunoglobulin)。由于IgY原料易得、制備簡單、不與類風濕因子以及哺乳動物的補體發(fā)生交叉反應，應用十分廣泛。目前IgY的分離純化方法復雜且耗時長，性質不穩(wěn)定，易受溫度、pH值、酶的影響。IgY免疫球蛋白的糖鏈在維持其理化性質、抗原特性等功能中扮演著重要角色，對IgY進行糖基化修飾不僅可以維持空間構象、穩(wěn)定糖蛋白結構、保護其免受某些蛋白酶裂解等方面有重要作用，而且

2、還能改變某些生物活性和抗原特性。因此對IgY蛋白質進行糖基化修飾，具有十分重要的意義。本論文通過建立一種高效、簡便的分離純化的方法，制備了不同種類單糖與聚糖糖基化IgY，比較糖基化修飾前后IgY的結構與功能性的關系。研究結果如下:
　　1.建立了一種適用于工業(yè)化生產高效、低成本的IgY提取方法。選用五種多糖（果膠、卡拉膠、羧甲基纖維素、甲基纖維素、硫酸葡聚糖）和五種濃度(0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％)配制

3、的去脂液，比較了其對IgY分離效果的影響，通過SDS-PAGE、Western blots以及HPLC對IgY的提取量、純度進行分析。果膠、硫酸葡聚糖、卡拉膠、羧甲基纖維素均在0.1％濃度時對IgY分離效果最好，提取量可分別達到8.36 mg/mL、9.31 mg/mL、7.64 mg/mL和8.1 mg/mL，純度分別達83.3％、80.1％、80.94％和79.94％，而甲基纖維素在0.15％處對IgY分離效果最好，其提取量和純度分

4、別為7.65 mg/mL，78.17％。ELISA分析表明提取的IgY均保持較高的免疫活性。綜合比較，由0.1％果膠配制的去脂液分離純化IgY的效果最好，提取量8.36mg/mL，純度83.3％。本方法能快速除去雞卵黃中的脂蛋白，操作簡單，適合工業(yè)化生產。
　　2.選擇了四種單糖（葡萄糖、果糖、巖藻糖、甘露糖）和不同糖鏈長度的葡聚糖(5000K、20000K、40000K、70000K)，利用美拉德反應分別對IgY進行糖基化修飾改

5、性，對其產物進行結構表征。紫外光譜和SDS-PAGE結果表明，單糖與聚糖糖基化修飾的IgY，褐變程度均隨著糖基化時間的增加而增大。其中，四種單糖中果糖最易發(fā)生糖基化反應，葡聚糖糖鏈長度越短，越易發(fā)生糖基化。同時，利用紅外、圓二光譜和熒光光譜監(jiān)測了糖基化IgY蛋白質隨糖基化時間的延長二級結構的變化。結果表明，隨著反應時間的延長，糖基化修飾IgY產物的熒光強度下降，說明其分子周圍疏水環(huán)境發(fā)生變化。CD光譜表明糖基化后IgY的α-螺旋程度升高

6、，β-折疊下降。氨基酸分析顯示糖基化后IgY賴氨酸和精氨酸的含量明顯減少。
　　3.對單糖與聚糖基化IgY產物的熱穩(wěn)定性進行了研究。DSC結果表明糖基化能明顯改善IgY的熱穩(wěn)定性。天然IgY的熱變性溫度為70.4℃，葡萄糖糖基化IgY熱變性溫度在反應18d達到最高(79.8℃)，甘露糖糖基化IgY在24 d提高到最高(77℃)，而果糖糖基化和巖藻糖糖基化IgY在12d提高到最高，分別達到78.5℃和79℃。本文也比較了四種不同糖鏈

7、長度的葡聚糖(5000K、20000K、40000K、70000K)糖基化對IgY熱穩(wěn)定性的影響。DSC結果表明，分子量5000聚糖修飾IgY產物的熱變性溫度在24 d達到最高(77.3℃)，分子量20000聚糖修飾IgY產物在18d達到最高值(75.9℃)，分子量40000聚糖修飾IgY在18d提高最大(74.5℃)，70000聚糖修飾IgY產物產物在12d提高最大(74℃)。
　　4.對單糖與聚糖糖基化IgY產物的免疫活性進行

8、了研究。ELISA結果表明，葡萄糖、甘露糖、巖藻糖、果糖IgY糖基化產物的免疫活性在反應到第6天達到最高，分別比天然IgY提分別提高了30.3％、13.7％、12％、22.4％。分子量5000的IgY葡聚糖糖基化產物在反應到達第24天達到最高，但比天然IgY降低14.3％，分子量20000、40000、70000的IgY葡聚糖糖基化產物在反應到達第6天最高，分別降低37.4％、40.4％、44.3％。同時發(fā)現，葡聚糖糖鏈長度越短，免疫活

9、性越高，其中G5000K＞G20000K＞G40000K＞G70000。
　　5.對單糖與聚糖糖基化IgY產物在模擬胃腸液中的穩(wěn)定性進行了研究。ELISA結果表明，天然IgY經過模擬胃腸液消化后活性保持率在20.1％。葡萄糖和巖藻糖糖基化IgY產物的免疫活性保持率均在18天達到最高，分別比天然IgY提高了201％和121％;甘露糖基化IgY產物在12天達到最高，比天然IgY提高了200％;果糖糖基化IgY產物在24天達到最高，比天