卵巨球蛋白純化、糖基化結(jié)構(gòu)及其特性研究.pdf

1、卵巨球蛋白是雞蛋清中的一種糖蛋白，含量為蛋清蛋白質(zhì)的0.5％，具有多種生物活性。目前，國(guó)內(nèi)尚未開展卵巨球蛋白的研究，鑒于此，本課題對(duì)卵巨球蛋白及其它蛋清蛋白質(zhì)快速、高效制備的基礎(chǔ)之上，解析卵巨球蛋白的糖基化結(jié)構(gòu)，研究其與金屬離子之間相互作用和調(diào)控成纖維細(xì)胞遷移的特性，為卵巨球蛋白的研究和應(yīng)用及其生物活性作用機(jī)制的闡明提供基礎(chǔ)。主要研究進(jìn)展如下:
　　(1)研究了聚乙二醇沉淀法對(duì)蛋清蛋白質(zhì)的分離效果，建立了蛋清主要蛋白質(zhì)的聯(lián)合純化方

2、法。雞蛋清經(jīng)稀釋、調(diào)節(jié)pH后，采用聚乙二醇分級(jí)沉淀分為4個(gè)組分;沉淀A經(jīng)氯化鈉溶液處理，獲得卵粘蛋白;沉淀B、沉淀C和上清D經(jīng)陰離子交換層析分離，獲得溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白和卵黃素蛋白。卵粘蛋白、溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白和卵黃素蛋白純度分別可達(dá)到82.4％、91.8％、94.6％、96.5％和88.2％，提取率分別為63.6％、30.1％、77.8％、88.6％和53.2％。溶菌酶活力為18500 U/mg，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵黃素

3、蛋白均保持了活性。該方法操作簡(jiǎn)便、快捷，具有規(guī)?；瘧?yīng)用的潛力，為蛋清蛋白質(zhì)的應(yīng)用提供了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。
　　(2)通過聚乙二醇分級(jí)沉淀濃度的優(yōu)化、層析類型的選擇和層析流程的改進(jìn)，建立了兩步層析純化卵巨球蛋白的方法。聚乙二醇分級(jí)沉淀獲得富含卵巨球蛋白蛋清組分后，采用離子交換層析和凝膠過濾層析純化。聚乙二醇分級(jí)沉淀濃度為4-8％;陰離子交換層析洗脫流速為2.5 mL/min，洗脫液氯化鈉濃度為0.18 mol/L;目標(biāo)收集液經(jīng)超濾濃縮

4、后，凝膠過濾層析純化，進(jìn)樣量為5mL，洗脫流速為1.0 mL/min。得到的卵巨球蛋白在SDS-PAGE電泳凝膠上為單一條帶。樣品經(jīng)質(zhì)譜被鑒定為“gi|45382565|ovostatin(Gallus gallus)”，即雞卵巨球蛋白。該方法減少了層析步驟，縮短了純化周期1/3以上，提取率由17％提高至37.8％，提高約120％。
　　(3)對(duì)卵巨球蛋白純化過程中分離參數(shù)進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化。使用5-9％的聚乙二醇對(duì)雞蛋清溶液沉淀，獲

5、得的組分通過凝膠過濾層析純化，洗脫液為磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)，流速為0.75 mL/min，進(jìn)樣量為3.0 mL。HPLC測(cè)定最終樣品純度為97.0％。經(jīng)電泳分析，卵巨球蛋白保持了抑制膠原酶的活性。原子力顯微鏡分析結(jié)果表明，卵巨球蛋白分子在固-氣界面上為圓盤狀，直徑38.0±4.0 nm，高度2.7±0.5 nm，分子形態(tài)完整。一步層析法僅需一種層析填料，降低了制備成本，操作簡(jiǎn)便，可在10-12h內(nèi)獲得純化的卵巨球蛋白，提取

6、率高達(dá)62.5％，對(duì)卵巨球蛋白的研究和應(yīng)用開發(fā)具有重要的意義。
　　(4)采用質(zhì)譜和二維電泳技術(shù)對(duì)卵巨球蛋白的糖基化結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析。MALDI-TOF-MS測(cè)定卵巨球蛋白亞基分子量為183.3 kDa，糖鏈部分的分子量為21.1kDa，占11.5％。將卵巨球蛋白去糖基化處理和酶解，HPLC-ESI-MS/MS對(duì)其N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)了11個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了糖基化，另一個(gè)位點(diǎn)(N1221)表現(xiàn)為糖基化和未糖基化兩種形式。通過與其他

7、鳥類巨球蛋白的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)了雞卵巨球蛋白N-糖基化位點(diǎn)的丟失現(xiàn)象。二維電泳結(jié)果顯示，卵巨球蛋白在170 kDa附近表現(xiàn)為一系列橫向分布的蛋白點(diǎn)，等電點(diǎn)范圍為5.03-6.03，顯現(xiàn)出顯著的不均一性。研究結(jié)果為卵巨球蛋白分子結(jié)構(gòu)和生物活性的研究提供了重要信息。
　　(5)研究了卵巨球蛋白與部分金屬離子相互作用的特性。熒光光譜分析發(fā)現(xiàn)，Zn2+對(duì)卵巨球蛋白的熒光具有增強(qiáng)作用，但速率常數(shù)為6.22×109 L/(mol·s)，未發(fā)生穩(wěn)定結(jié)

8、合;Cu2+和Fe3+對(duì)卵巨球蛋白的熒光具有猝滅作用，猝滅速率常數(shù)分別為4.13×1011 L/(mol·s)和1.16×1012 L/(mol·s)，為靜態(tài)猝滅，表明發(fā)生了較為穩(wěn)定的結(jié)合，結(jié)合常數(shù)分別為5.27×102 L/mol、9.57×105 L/mol，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為0.8、1.2。同步熒光光譜結(jié)果表明，Cu2+使其色氨酸殘基最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移。CD光譜和傅FT-IR光譜研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+、Fe3+使卵巨球蛋白的β-折疊結(jié)

9、構(gòu)減少，無序結(jié)構(gòu)增加。根據(jù)研究結(jié)果，提出卵巨球蛋白除通過“誘捕”作用抑制金屬蛋白酶外，還可與金屬蛋白酶競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合金屬離子，實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬蛋白酶更強(qiáng)的抑制。
　　(6)研究了卵巨球蛋白對(duì)成纖維細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用。以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(3T6)和人皮膚原代成纖維細(xì)胞(HSF)為模型，結(jié)果顯示，卵巨球蛋白對(duì)3T6細(xì)胞的生長(zhǎng)數(shù)目、細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖周期均無顯著的影響，同時(shí)對(duì)生長(zhǎng)因子FGF、TGF-β無顯著的調(diào)控作用，表明其對(duì)細(xì)胞增殖無調(diào)控作

10、用。劃痕實(shí)驗(yàn)和粘附實(shí)驗(yàn)表明，200 nmol/L卵巨球蛋白可使3T6細(xì)胞和HSF細(xì)胞的遷移速度分別提高25％和28％，使HSF細(xì)胞的粘附率提高78％;同時(shí)，卵巨球蛋白可上調(diào)β1-整合素(β1-integrin)、β-微管蛋白(β-tubulin)和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的表達(dá)，下調(diào)E型鈣粘素(E-eadherin)的表達(dá)。據(jù)此，提出卵巨球蛋白可通過增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附、降低細(xì)胞與細(xì)胞之間的聚集、加強(qiáng)細(xì)胞骨架，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞