普魯蘭生物合成及其高產(chǎn)策略研究.pdf

1、普魯蘭（pullulan）是由麥芽三糖單體經(jīng)α-1,6-糖苷鍵聚合而成的線性水溶性多糖，具有良好的成膜性、成纖維性、阻氧性、可塑性、粘結(jié)性、降解性及生物安全性等特性，可以安全地運(yùn)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。
　　本文以一株出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）菌株為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行誘變篩選，獲得了不產(chǎn)色素的菌株，并在此基礎(chǔ)上以產(chǎn)量和分子量為指標(biāo)進(jìn)行培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　

2、1.以A. pullulans ATCC201253為出發(fā)菌株，采用UV和γ-射線對(duì)其進(jìn)行復(fù)合誘變，經(jīng)過平板篩選，得到一株不產(chǎn)色素菌株A. pullulans CCTCC M2012259，其遺傳性狀穩(wěn)定，合成普魯蘭的能力較強(qiáng)，具有良好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。
　　2.以A. pullulans CCTCC M2012259作為研究對(duì)象，在搖瓶發(fā)酵條件下，采用單因素實(shí)驗(yàn)和分式析因設(shè)計(jì)，研究了營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)普魯蘭產(chǎn)量和分子量的影響，結(jié)果顯示

3、K2HPO4和 NaCl對(duì)分子量影響顯著，酵母粉和(NH4)2SO4對(duì)普魯蘭的產(chǎn)量影響很大。采用L9(34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，獲得了高分子量普魯蘭合成的營(yíng)養(yǎng)物組合為：50 g/L葡萄糖，1.0 g/L酵母粉，0.3 g/L(NH4)2SO4，1.0 g/L K2HPO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，最大分子量為5.74×106。采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，獲得普魯蘭高產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)物組合為：50 g/L葡萄糖，3.

4、0 g/L酵母粉，2.0 g/L K2HPO4，0.6 g/L(NH4)2SO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，1.0 g/L NaCl，最大普魯蘭產(chǎn)量為25.65 g/L，對(duì)底物葡萄糖的得率為51.3%。
　　3.考察了pH對(duì)普魯蘭分批發(fā)酵的影響。A. pullulans CCTCC M2012259能夠在不同恒定pH（2.5-6.5）或者不控制pH條件下生長(zhǎng)、合成普魯蘭，pH在3.0-4.5之間時(shí)有利于普魯蘭的生產(chǎn)。在

5、分批發(fā)酵結(jié)果的基礎(chǔ)上，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法預(yù)測(cè)最適pH為3.8，在此pH下，細(xì)胞量和普魯蘭產(chǎn)量分別為8.1 g/L和26.8 g/L。此外，通過研究A. pullulans CCTCC M2012259菌體細(xì)胞的生理特性，如胞內(nèi)pH（pHi）、NADH/NAD+、ATP/ADP等，證實(shí)了細(xì)胞具有較強(qiáng)的維持胞內(nèi)pH的能力。在酸性條件下，通過抗逆系統(tǒng)，維持較高的胞內(nèi)pH，從而使細(xì)胞能適應(yīng)各種胞外pH環(huán)境。
　　4.研究了溫度對(duì)A. pull

6、ulans CCTCC M2012259細(xì)胞生長(zhǎng)和普魯蘭合成的影響，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)溫度變化不敏感，普魯蘭的合成能力差異不顯著。通過比較不同溫度下的普魯蘭發(fā)酵結(jié)果，發(fā)現(xiàn)28℃是普魯蘭發(fā)酵生產(chǎn)的最佳溫度，產(chǎn)量為30.58 g/L。24℃是高分子量普魯蘭合成的最佳溫度，48 h時(shí)的分子量為609萬，72 h時(shí)普魯蘭分子量仍然高達(dá)390萬。
　　5.分析了攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)普魯蘭生物合成的影響，發(fā)現(xiàn)過低的轉(zhuǎn)速（300 rpm及以下）會(huì)導(dǎo)致供氧不足，