云南溫泉棲熱菌熱穩(wěn)定性普魯蘭酶高產(chǎn)菌株篩選的初步研究.pdf

1、棲熱菌是地?zé)岣邷鼐牡湫痛?，是高溫生物學(xué)基礎(chǔ)性研究和應(yīng)用性研究的重點(diǎn)菌群，與水熱環(huán)境關(guān)系密切，呈世界性分布，除各地地?zé)釡厝?，人工水熱環(huán)境如熱水管道及自熱的堆肥，海底火山口附近都曾分離到棲熱菌株，棲熱菌的應(yīng)用開(kāi)發(fā)也取得了很大的進(jìn)展，最具代表性的就是產(chǎn)自棲熱菌的Taq酶應(yīng)用于PCR反應(yīng)，帶來(lái)分子生物學(xué)的巨大發(fā)展。云南水熱活動(dòng)區(qū)數(shù)量為全國(guó)第一，其中騰沖又居云南之首，而且它是中國(guó)大陸上唯一的火山地?zé)釁^(qū)。全縣有95個(gè)水熱顯示區(qū)，活動(dòng)強(qiáng)度高，其

2、中蘊(yùn)含的微生物資源也非常豐富。 普魯蘭酶(Pulullanase)是淀粉酶的一種，能專一性的水解曲霉多糖(Pullulan)，淀粉，支鏈淀粉和相應(yīng)的低聚糖中的α-1，6糖苷鍵的一種脫枝酶(Abdullabetal，1960).普魯蘭酶既能分解支鏈淀粉產(chǎn)生還原糖，也能水解普魯蘭多糖產(chǎn)生還原糖，在淀粉深加工、啤酒釀造等多種工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多種微生物都能分解支鏈淀粉產(chǎn)生普魯蘭酶，如芽孢菌、產(chǎn)氣氣桿菌、放線菌、棲熱菌

3、等。工業(yè)應(yīng)用的普魯蘭酶多是由芽孢菌等微生物產(chǎn)生的，目前世界上只有丹麥的NOVO公司得到的芽孢桿菌所產(chǎn)生的普魯蘭酶具有廣泛的應(yīng)用。棲熱菌普魯蘭酶的研究只處于起步狀態(tài)，只有國(guó)外少數(shù)科研機(jī)構(gòu)進(jìn)行過(guò)初步的研究，篩選得到的棲熱菌菌株普魯蘭酶活力并不高，只有1u/ml左右，很難應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)對(duì)普魯蘭酶的研究只局限于江南大學(xué)、蘭州大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院微生物研究所和江蘇生物研究所等少數(shù)高校和科研單位，研究只局限于篩選高活力菌株，對(duì)所得到的菌株進(jìn)行誘導(dǎo)

4、、誘變，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化等方面。篩選得到的菌株只有芽孢菌，產(chǎn)氣氣桿菌等，到目前酶的活力還比較低，最高檢測(cè)到的活力只有8.8u/ml，工業(yè)應(yīng)用前景還很渺茫。 本研究從云南高溫?zé)崛泻Y選得到60株非芽孢菌菌株，對(duì)這些菌株產(chǎn)普魯蘭酶性狀進(jìn)行了篩選，分別檢測(cè)了各菌株的α-淀粉酶、β-淀粉酶、異淀粉酶和普魯蘭酶活性，得到了一株普魯蘭酶初始酶活力比較高的菌株WQBGR2-3，初始酶活力達(dá)到0.069u/ml，該菌株WQBGR2-3為產(chǎn)紅色

5、色素、非芽孢的革蘭氏陰性桿菌，該細(xì)菌在平板上能形成圓形、邊緣平整、半透明，長(zhǎng)桿狀單一分布或者形成鏈狀，無(wú)鞭毛，沒(méi)有運(yùn)動(dòng)性。針對(duì)該菌株進(jìn)行了生理生化實(shí)驗(yàn)，包括淀粉水解實(shí)驗(yàn)，過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)等35個(gè)指標(biāo)，根據(jù)對(duì)細(xì)菌WQBGR2-3的形態(tài)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)，按伯杰氏《細(xì)菌鑒定手冊(cè)》初步鑒定為棲熱菌目棲熱菌科的亞棲熱菌屬。 對(duì)酵母粉、蛋白胨、支鏈淀粉等幾種對(duì)該菌株產(chǎn)酶有重要影響的因素進(jìn)行了研究，找到了各因素對(duì)菌株WQBGR2-3產(chǎn)生普魯蘭

6、酶影響較大的濃度范圍，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定了可溶性淀粉、蛋白胨和酵母粉等因素的一次作用、二次作用、交互作用對(duì)酶產(chǎn)量的影響的數(shù)學(xué)模型為：Y=-1347.51+602.915x1+315.624x2+303.589x3-16.04979x1x2+14.4604x1x3-20.6594x2x3-80.9607x12-174.273x22-127.019x32 根據(jù)數(shù)學(xué)模型確定了產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)基配比，即支鏈淀粉為3.73684g/L、酵母

7、粉為0.918875g/L、蛋白胨采用0.674187g/L。優(yōu)化后的培養(yǎng)基對(duì)酶活力提高影響巨大，使該酶的活力從初步篩選時(shí)的0.069u/ml，上升至24u/ml,檢測(cè)到的最高酶活力達(dá)到了170u/ml，使酶的產(chǎn)量提高了將近2500倍。 利用優(yōu)化好的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌WQBGR2-3，對(duì)該菌株進(jìn)行進(jìn)一步誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)酶活力有繼續(xù)提高的趨勢(shì)。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行離心，棄掉菌體后，對(duì)上清中的胞外普魯蘭酶進(jìn)行分離純化，采用丙酮沉淀、鞣酸沉淀、凝