真菌漆酶高效定向固定化新策略探索.pdf

1、漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，能夠催化芳香胺和酚類等多種芳香化合物的氧化，同時(shí)伴隨分子氧還原成水。漆酶的催化特征使其不但在木素降解、紙漿漂白、印染廢水脫色與脫毒等工業(yè)和環(huán)保方面有著廣泛應(yīng)用，同時(shí)在生物傳感器和生物燃料電池的開發(fā)上也極具應(yīng)用價(jià)值。
　　和大多數(shù)水溶性酶一樣，漆酶的固定化是實(shí)現(xiàn)應(yīng)用價(jià)值的必要途徑。傳統(tǒng)的酶固定化方法，大多是通過酶外表面氨基酸殘基上的功能基團(tuán)與載體進(jìn)行作用而連接。這可能會(huì)導(dǎo)致酶多個(gè)位點(diǎn)和載體結(jié)合，破壞了酶的

2、天然構(gòu)象，使固定化酶活性大幅度下降，同時(shí)酶分子不恰當(dāng)?shù)目臻g取向，也可能使得固定化酶的活性位點(diǎn)與底物的接觸受阻，使催化效率大大降低。因此，定向、高效成為酶固定化方法研究的關(guān)鍵。
　　已報(bào)道的酶定向固定化方法中，有的依靠酶與載體（修飾）之間親和作用，有的依靠蛋白的特定的氨基酸殘基與載體上對(duì)應(yīng)的偶聯(lián)基團(tuán)之間的共價(jià)結(jié)合。目前，單一活性中心酶的定向固定化技術(shù)的研究取得了一定的進(jìn)展。
　　漆酶是一個(gè)單鏈多氧化還原活性中心的大分子，這一結(jié)

3、構(gòu)特征使得固定化漆酶的催化效率在很大程度上依賴其在載體表面上的取向。就酶電極而言，不同的取向不僅影響其直接電子轉(zhuǎn)移途徑，還影響其生物電催化氧還原效率。因此，漆酶的高效定向固載是漆酶利用的關(guān)鍵。有關(guān)漆酶的定向固定化研究的報(bào)道，迄今為止仍然相對(duì)較少。因此，探索漆酶定向、高效的固定化新方法，對(duì)漆酶功能器件的開發(fā)具有重要意義。
　　本論文分別從漆酶自身的生物修飾和/或載體的化學(xué)修飾等不同角度，嘗試建立了幾種漆酶高效定向固載新策略。

4、　　一、漆酶的生物修飾
　　相比于蛋白本身的化學(xué)修飾，功能蛋白的定點(diǎn)生物修飾是實(shí)現(xiàn)功能蛋白定向組裝的理想手段之一。目前，生物學(xué)上對(duì)漆酶基因進(jìn)行克隆和序列分析已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，并且實(shí)現(xiàn)了其高效的重組表達(dá)（或異源表達(dá)）。以此為基礎(chǔ)，以漆酶的定向固定化為目標(biāo)，本文首先利用分子生物學(xué)的方法將漆酶進(jìn)行了定點(diǎn)生物修飾。
　　借助于半胱氨酸的側(cè)鏈巰基和金基底形成的硫-金鍵常用來構(gòu)建自組裝修飾電極。因此在漆酶的氮端或碳端引入半胱氨酸將為漆

5、酶的定向固定帶來便利。而組氨酸的咪唑基團(tuán)與金屬離子的特異性親和作用，也常常被用于蛋白的純化和固定。
　　本節(jié)首先設(shè)計(jì)了一段編碼Cys-(His×6)-短肽的基因序列，通過基因重組的方法，將這段序列融合到來源于Trametessp.AH28-2的漆酶基因1acA的3'/5'端，并構(gòu)建了表達(dá)載體，再經(jīng)過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母中進(jìn)行了漆酶的異源高效表達(dá)，最終成功獲得了分別在N端和C端帶有Cys-(His×6)-短肽的重組漆酶rLacA-N和

6、rLacA-C。對(duì)重組漆酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)表征，結(jié)果表明兩種重組漆酶和非重組漆酶具有相似的酶學(xué)性質(zhì)，說明對(duì)漆酶的生物修飾沒有對(duì)酶本身性質(zhì)產(chǎn)生大的影響，為后續(xù)的固定化打好了基礎(chǔ)。
　　二、重組漆酶在金電極上定向固定化策略
　　漆酶在常規(guī)電極上的直接電子轉(zhuǎn)移現(xiàn)象不易觀察到。不僅如此，還發(fā)現(xiàn)隨機(jī)取向漆酶的電催化氧還原伴隨著中間體過氧化氫的產(chǎn)生，影響電子轉(zhuǎn)移效率。由此可見，電極上漆酶的定向組裝是提高直接電子轉(zhuǎn)移效率、構(gòu)建漆酶電化學(xué)生物

7、傳感器和生物燃料電池等功能器件的關(guān)鍵步驟。
　　利用重組漆酶蛋白鏈末端的半胱氨酸殘基，與金電極形成的Au-S鍵，將重組漆酶定向地組裝到平面金電極表面上。
　　酶活測(cè)量表明，固定化漆酶能夠較好地保持原有的生物活性。漆酶電極的循環(huán)伏安法表征又表明，兩種重組漆酶在金電極表面均發(fā)生了直接電子轉(zhuǎn)移，對(duì)氧也表現(xiàn)出生物電催化活性。然而兩種重組漆酶電極的直接電化學(xué)行為卻表現(xiàn)出明顯差異，對(duì)氧的生物電催化還原效率及其還原產(chǎn)物也有差異。分析表明，

8、金電極表面上不同取向漆酶的直接電子轉(zhuǎn)移途徑與難易程度不一樣。T1位點(diǎn)靠近電極表面易于漆酶對(duì)氧的生物電催化還原。
　　上述漆酶在電極上定向固定的研究不但有助于深化對(duì)漆酶直接電化學(xué)機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也有助于基于漆酶的生物燃料電池的研發(fā)。
　　三、重組漆酶在瓊脂糖載體的定向固定化策略
　　將氮端或碳端帶有His×6-短肽鏈的重組漆酶，通過組氨酸與Ni2+離子的螯合作用，定向地組裝到氨基三乙酸-Ni2+-修飾的瓊脂糖載體表面上。在這

9、個(gè)固定化體系中，由于固定位點(diǎn)位于漆酶分子表面、遠(yuǎn)離漆酶活性中心，有利于漆酶結(jié)構(gòu)的保持，使固定化漆酶可以保持較高的催化活性;同時(shí)多組氨酸鏈作為位點(diǎn)，也增加了固定化漆酶的穩(wěn)定性;最重要的是，依靠漆酶本身定點(diǎn)生物修飾的氨基酸鏈作為固定位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了漆酶取向單一、取向可控的高效固定化。
　　固定化漆酶酶活測(cè)量結(jié)果表明，在相同條件下不同取向的兩種固定化漆酶表現(xiàn)出不同的催化活性;然而酶結(jié)構(gòu)的圓二色譜分析表明，不同取向漆酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化不大。分析

10、表明，這可能是由于固定化T1位點(diǎn)的外露程度不同，導(dǎo)致底物的可觸及性不同所致。研究結(jié)果還表明，固定化酶比游離酶有更高的熱穩(wěn)定性，同時(shí)具有較高的重復(fù)利用性。
　　四、非重組漆酶在單壁碳納米管上親和固定化策略
　　漆酶是一種糖蛋白酶，其表面的糖基可以作為固定化的位點(diǎn)。將固定載體——單壁碳納米管用表面活性劑十二烷基麥芽糖苷進(jìn)行表面修飾，利用伴刀豆蛋白對(duì)糖基的特異性親和作用，同時(shí)又憑借表面活性劑對(duì)碳納米管的分散作用，從增加碳納米管比表

11、面積、減少酶結(jié)構(gòu)改變、增加固定化酶的穩(wěn)定性等方面出發(fā)，構(gòu)建了單壁碳納米管-烷基糖苷-伴刀豆蛋白-糖蛋白酶固定化新體系。
　　分別以漆酶和辣根過氧化物酶為例研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種新型固定化方法，與兩種酶直接固定于碳納米管上相比，在酶的上載量、比活力、穩(wěn)定性等方面，都有很大的優(yōu)勢(shì)。圓二色譜和熒光光譜分析測(cè)試酶的結(jié)構(gòu)變化結(jié)果表明，單壁碳納米管-烷基糖苷-伴刀豆蛋白復(fù)合載體和單壁碳納米管相比，對(duì)酶的結(jié)構(gòu)影響較小，這也是新體系中酶的比活力