矮牽牛PMADS20基因的克隆及其功能的初探.pdf

1、矮牽牛PMADS20基因是MADS—box基因STMADS11亞家族成員之一。MADS—box基因是廣泛存在于動(dòng)物、植物和真菌中的一類轉(zhuǎn)錄因子，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控一系列基因是否轉(zhuǎn)錄，何時(shí)轉(zhuǎn)錄，并決定轉(zhuǎn)錄的頻率。生命有機(jī)體的不同器官、組織及其發(fā)育生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期都存在轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)。STMADS11亞家族基因的主要功能是控制營(yíng)養(yǎng)器官各個(gè)時(shí)期的發(fā)育以及在空間和時(shí)間上決定營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變。通過(guò)分析PMADS20基因及STMADS11亞

2、家族其它成員的序列，表明PMADS20基因可能矮牽牛芽的形成有關(guān)，從而促進(jìn)矮牽牛向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變。
　　 轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor，TF)又稱之為反式作用因子，與順式作用元件的啟動(dòng)子特定DNA序列相互識(shí)別、結(jié)合，從而直接或間接調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的精確起始和轉(zhuǎn)錄效率。轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力可分為轉(zhuǎn)錄激活子和轉(zhuǎn)錄抑制子。根據(jù)轉(zhuǎn)錄抑制蛋白的不同，及作用方式的不同，分為主動(dòng)抑制轉(zhuǎn)錄因子和被動(dòng)抑制轉(zhuǎn)錄因子。其次，根據(jù)

3、與DNA結(jié)合途徑的不同，可再次分為MYB類、bHLH類、bZIP類、鋅指類和AP2/EREBP類。植物主動(dòng)抑制子還可以根據(jù)其抑制結(jié)構(gòu)域繼續(xù)分類。關(guān)于植物轉(zhuǎn)錄抑制因子的研究還不夠完善，目前，以EAR結(jié)構(gòu)為例。EAR結(jié)構(gòu)域是一種抑制結(jié)構(gòu)域，僅含有12個(gè)氨基酸序列，在轉(zhuǎn)基因擬南芥植物中具有主動(dòng)抑制子的作用，不僅抑制特定目的基因的表達(dá)，同時(shí)也在一些轉(zhuǎn)錄因子中出現(xiàn)，并產(chǎn)生一些顯性功能缺失的表型。抑制結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)錄抑制因子和相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的中心

4、，不同的轉(zhuǎn)錄因子與不同的EAR結(jié)構(gòu)聚合在一起，可以抑制目的基因的表達(dá)[2]。因此，融合抑制轉(zhuǎn)錄因子沉默技術(shù)(CRES-T)成為新的基因沉默技術(shù)之一。
　　 首先，本實(shí)驗(yàn)使用PCR法，從矮牽牛葉片cDNA中克隆得到了PMADS20基因的編碼區(qū)(GenBank:GU129907)。其次，通過(guò)基因比較分析發(fā)現(xiàn)，PMADS20基因與擬南芥SVP基因和AGL24基因有較高的同源性，屬于MADS-box基因STMADS11亞家族。第三，使用

5、熒光定量分析表明PMADS20基因在根、莖、葉中表達(dá)，特別是腋芽中優(yōu)先表達(dá)。最后，通過(guò)構(gòu)建PMADS20基因植物超量表達(dá)載體PG-503和通過(guò)融合抑制基因沉默技術(shù)(chimericrepressorgene-silencingtechnology，CRES-T)構(gòu)建PMADS20基因融合沉默載體PG-504;利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將PMADS20基因介導(dǎo)進(jìn)入矮牽牛葉片，在篩選培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織，進(jìn)而篩選出含有目的基因及抗除草劑標(biāo)記基因的

6、幼苗，最后獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。現(xiàn)已得到并鑒定PG503與PG504轉(zhuǎn)基因各35個(gè)株系。PG503轉(zhuǎn)基因植物與野生型對(duì)照植株相比，無(wú)明顯表型;但PG504轉(zhuǎn)基因植物與野生型對(duì)照植株相比，表型明顯，植株株高下降，分支稠密，節(jié)間縮短，葉片狹長(zhǎng)，開(kāi)花時(shí)間推遲，推測(cè)PMADS20基因可能對(duì)植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)起促進(jìn)作用。同時(shí)推測(cè)其下游可能存在功能冗余基因，共同調(diào)控植物相關(guān)生命活動(dòng)。目前，對(duì)PMADS20基因功能分析和驗(yàn)證取得了一定的成功，對(duì)于