矮牽牛PMADS3及其互作候選基因功能初步分析.pdf

1、矮牽牛(Petuniahybrida)為茄科（Solanaceae）矮牽牛屬（PetuniaJuss.）草本花卉，被廣泛應用于園林中，同時它也是研究植物花發(fā)育遺傳機理的重要模式植物之一。自上世紀九十年代以來，人們就對矮牽?；ㄆ鞴侔l(fā)育機制展開了深入研究，并提出了花發(fā)育的ABCDE模型。其中，PMADS3是從矮牽牛中克隆出來的C功能基因，其組織原位表達固定在第三、四輪花器官上，同時具有花分生組織和花器官決定的功能，超量表達PMADS3基因會

2、使野生型矮牽牛的花瓣上出現(xiàn)花藥結構以及花萼心皮化，而PMADS3基因被抑制則雄蕊出現(xiàn)明顯的瓣化。由此可見，PMADS3基因與第二、三輪花器官同源異型轉換存在極大的關系，即與重瓣基因存在關系。因此，對矮牽牛PMADS3及其互作基因展開研究不僅對重瓣育種具有極其重要的意義，而且雄蕊瓣化性狀還可以應用于創(chuàng)造不育系。
　　為了進一步探索PMADS3在矮牽牛中調控花器官發(fā)育的具體途徑，發(fā)掘出與其相互作用的相關調控因子，本實驗將PMADS3全

3、長的干涉載體轉化矮牽牛，觀測表型并進一步利用實時定量PCR技術分析在轉基因植株中其他相關花發(fā)育基因的表達情況;同時從前期實驗室篩選出的與PMADS3互作的基因中挑選5個，并采用Gateway技術構建了RNAi載體，利用農桿菌介導法轉化矮牽牛，獲得轉基因植株并分析表型。實驗主要內容及結果如下:
　　1、PMADS3基因全長干涉載體轉化矮牽牛分析表型。采用根癌農桿菌介導法將PMADS3干涉載體轉化矮牽牛并利用PCR技術檢測轉基因植株。

4、在獲得的陽性植株中，有67％的植株表現(xiàn)出雄蕊不同程度的瓣化，同時子房增大，但空癟、內陷明顯，花柱短小，柱頭頂端閉合，后期全部無法結實。
　　2、轉基因矮牽牛中其他相關基因的實時定量PCR分析。以GAPDH為內參基因，前期課題組篩選出的與單重瓣相關的表達基因為目的基因，實時定量PCR檢測其在轉基因植株中的表達水平。結果表明，在轉干涉載體Phellsgate2-PMADS3的強表型植株和未轉化對照植株之間，表達量差異顯著的轉錄因子主要

5、有FBP6，F(xiàn)BP7，PMADS3，PMADS4，PMADS9，PMADS15。其中，在轉基因植株中下調表達的基因有FBP6，F(xiàn)BP7，PMADS3，PMADS4，PMADS9，上調表達的基因為PMADS15。目標基因PMADS3在轉化植株中相對表達量僅為0.09，表現(xiàn)為極顯著的下調表達。
　　3、利用Gateway技術構建矮牽牛中與PMADS3互作的5個基因的RNAi載體。提取矮牽牛RNA，RT-PCR獲得其cDNA，然后PCR

6、擴增含有attB接頭的目的基因，將attB-PCR產物與Phellsgate2表達載體在BP酶作用下進行重組反應獲得RNAi載體Phellsgate2-AD23、Phellsgate2-AD30、Phellsgate2-AD35、Phellsgate2-AD63和Phellsgate2-AD66。
　　4、矮牽牛PMADS3的互作候選基因轉化矮牽牛。采用根癌農桿菌介導法將AD23、AD30、AD35、AD63、AD66共5個互作基

7、因的干涉載體轉化矮牽牛并利用PCR技術檢測轉基因植株，最終分別獲得陽性植株25株、20株、23株、23株和27株。在獲得的AD63轉基因植株部分株系中，T0代在營養(yǎng)期葉片皺縮反卷，葉片變厚，整株呈蓮座狀，頂端分生組織消失;花期雄蕊弱瓣化，子房增大，略顯皺縮，不飽滿，后期仍然能夠正常結實，但T0代種子活性降低。T1代植株開花期雄蕊瓣化現(xiàn)象得到了明顯的加強，表現(xiàn)為雄蕊瓣化的強表型，花藥頂端衍生出明顯的花瓣狀結構。其它四個基因轉化的矮牽牛未得