矮牽牛單重瓣相關(guān)基因的序列比較分析及功能驗(yàn)證.pdf

1、有關(guān)花發(fā)育的研究一直是植物領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)，從二十多年前ABC模型的提出，到現(xiàn)在的ABCDE模型，該理論研究仍在不斷的拓展和深入。重瓣花作為一類高觀賞價(jià)值與高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物材料，一直是品種培育的目標(biāo)之一。對(duì)于其形成機(jī)理，人們進(jìn)行了大量的研究，其中多是基于花發(fā)育的模型，利用正向遺傳學(xué)與反向遺傳學(xué)的方法對(duì)植物材料進(jìn)行研究，研究成果多集中在B類基因與C類基因上。對(duì)于矮牽牛而言，作為研究花發(fā)育的模式植物之一，其重瓣花的性狀表現(xiàn)為雄蕊瓣化和雄蕊數(shù)

2、目的增多。已有研究證明C類基因PMADS3和FBP6的功能同時(shí)缺失可以將雄蕊轉(zhuǎn)變?yōu)榛ò?，同時(shí)失去花分生組織的決定性，但是花器官的數(shù)目并沒(méi)有增多。于是我們推測(cè)，在矮牽牛重瓣花的形成過(guò)程中，還有其他基因的共同參與。遂本實(shí)驗(yàn)室以保存的單重瓣矮牽牛近等基因系為材料，在先期進(jìn)行了抑制消減雜交分析，基因芯片分析，實(shí)時(shí)定量PCR分析等一系列實(shí)驗(yàn)，獲得了一些與單重瓣形成有關(guān)的基因:PMADS3(gi|313112), FBP6(gi|374086023

3、),PMADS12(gi|34452082), FBP20（gi|13384053），scPD4（gi|227581095），sshPD1（gi|20492）。本實(shí)驗(yàn)的目的即對(duì)這些基因進(jìn)行分析和功能驗(yàn)證。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴分別以單瓣矮牽牛與重瓣矮牽牛的基因組DNA為模版?？寺×艘韵滦蛄?PMADS3的啟動(dòng)子與基因全長(zhǎng)，F(xiàn)BP6的啟動(dòng)子與第二內(nèi)含子，PMADS12的啟動(dòng)子，F(xiàn)BP20的啟動(dòng)子，scPD4的啟動(dòng)子，sshPD

4、1的啟動(dòng)子。比較這些序列在單瓣矮牽牛與重瓣矮牽牛之間存在的差異，結(jié)果表明上述序列在單瓣矮牽牛與重瓣矮牽牛之間不存在顯著差異，特別是關(guān)鍵元件的位點(diǎn)上不存在差異。⑵根據(jù)上述基因在單重瓣矮牽牛中的表達(dá)量差異，運(yùn)用Gateway技術(shù)構(gòu)建了PMADS12，F(xiàn)BP20，scPD4，sshPD1的干涉載體，并轉(zhuǎn)化矮牽牛W115，獲得轉(zhuǎn)基因植株P(guān)MADS12干涉載體23棵，F(xiàn)BP20干涉載體18棵，scPD4干涉載體20棵，sshPD1干涉載體28棵。

5、將前人構(gòu)建好的PMADS12超表載體轉(zhuǎn)化矮牽牛W115，獲得轉(zhuǎn)基因植株12棵。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的園藝學(xué)性狀進(jìn)行觀測(cè)，在一顆PAMDS12的超表植株上觀察到:雄蕊直接生長(zhǎng)于花瓣上，花絲與花瓣融合。其他轉(zhuǎn)基因植株沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與花發(fā)育相關(guān)的性狀，營(yíng)養(yǎng)器官及植株的長(zhǎng)勢(shì)也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與野生植株存在顯著差異。⑶根據(jù)上述結(jié)果，我們分析這些基因在單重瓣矮牽牛中的表達(dá)出現(xiàn)差異不是由它們的啟動(dòng)子造成的。特別是已被證明與單重瓣形成直接相關(guān)的PMADS3與FBP6，它們的