矮牽牛PMADS9基因的啟動(dòng)子克隆與功能分析.pdf

1、MADS-box基因是一類廣泛存在于植物中的同源異型基因，在生物體不同的組織以及生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段都存在MADS-box基因的表達(dá)，它屬于一個(gè)古老的基因家族，是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中重要的調(diào)控因子。目前對(duì)MADS-box基因調(diào)控機(jī)理的研究已成為植物分子生物學(xué)領(lǐng)域中的一大熱點(diǎn)。矮牽牛PMADS9基因是MADS-box基因AGL15亞家族的成員，該亞家族基因可能具有調(diào)控開花時(shí)間、抑制花器官衰老脫落和促進(jìn)體胚形成等功能。
　　 通過RAC

2、R技術(shù)和YADE法，我們分別從矮牽牛小花蕾RNA和葉片DNA基因組中克隆得到了PMADS9基因的編碼區(qū)(GenBank登錄號(hào)：DQ418547)和5’端翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游1053bp的啟動(dòng)子序列(GenBank登錄號(hào)：FJ798977)。然后在兩端設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)從基因組DNA中擴(kuò)增得到了全長(zhǎng)基因序列共5861bp(GenBank登錄號(hào)為EU338501)。RACE分析發(fā)現(xiàn)該基因至少有4個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)，2個(gè)位于

3、編碼區(qū)第一外顯子內(nèi)。
　　 本研究，繼續(xù)克隆了PMADS9基因上游未知的啟動(dòng)子區(qū)域，獲得了更長(zhǎng)的800bp序列，并對(duì)該啟動(dòng)子的功能進(jìn)行了初步地研究，這對(duì)于進(jìn)一步了解PMADS9基因表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)，以及更深入研究矮牽?；ㄆ鞴侔l(fā)育的分子機(jī)理都有著重要的意義。
　　 本文所取得的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)論如下：
　　 1.在已獲1053bp啟動(dòng)子序列的基礎(chǔ)上，利用hiTAIL-PCR技術(shù)對(duì)矮牽牛PMADS9基因上游未知啟動(dòng)子序列進(jìn)行

4、了再擴(kuò)增，獲得了更長(zhǎng)的800bp啟動(dòng)子片段，用SeqMan軟件對(duì)新獲取的序列與原有1053bp序列進(jìn)行了拼接，最終獲得了PMADS9基因全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列1853bp。
　　 2.運(yùn)用PLACE和PlantCare等在線分析軟件對(duì)該序列進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，該啟動(dòng)子除了具有TATA-box和CAAT-box等基本轉(zhuǎn)錄元件外，還富含花粉和種子發(fā)育過程中特異表達(dá)所需的調(diào)控元件，以及與環(huán)境應(yīng)答相關(guān)的各種順式調(diào)控元件。FootPrinter分析表

5、明，AGL15同源基因啟動(dòng)子之間存在非常保守的RY-repeat元件，啟動(dòng)子的保守性與物種的遺傳距離不一致；推測(cè)PMADS9基因翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游200～400bp和800～1000bp區(qū)域具有重要的功能。
　　 3.應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行5’缺失；用各缺失片段替換表達(dá)載體pCAMBIA1305.1中的CaMV35S組成型啟動(dòng)子序列，與GUS報(bào)告基因連接，成功構(gòu)建了所有缺失重組表達(dá)載pCAMBIA1305.1空載

6、為陽(yáng)性對(duì)照，轉(zhuǎn)化矮牽牛V1。GuS染色與PCR鑒定表明，成功實(shí)現(xiàn)了各表達(dá)載體對(duì)矮牽牛的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。
　　 4.待移栽后的轉(zhuǎn)基因植株開花后，對(duì)其進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析，結(jié)果表明全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列(1853bp)轉(zhuǎn)化后的陽(yáng)性植株，在莖、營(yíng)養(yǎng)葉、苞葉以及花萼中幾乎檢測(cè)不到GUS活性；GUS基因在雄蕊、雌蕊、子房中有較高的表達(dá)豐度，在花瓣中也有一定豐度的表達(dá)，這與之前PMADS9基因表達(dá)分析的結(jié)果基本一致。在轉(zhuǎn)基