染料木素在小鼠過(guò)敏性腹瀉模型中抗過(guò)敏作用及作用機(jī)制的研究.pdf

1、近年來(lái)食物過(guò)敏的發(fā)病率不斷增加，這類疾病在嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏性休克，甚至死亡。對(duì)于食物過(guò)敏，目前還沒(méi)有有效的治療方法，嚴(yán)格避免與過(guò)敏原接觸是臨床上最重要的預(yù)防措施。染料木素(Genistein，GEN)是從大豆中提取的一種異黃酮類化合物，具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，由于其在乳腺癌、前列腺癌、心血管疾病、骨質(zhì)疏松和絕經(jīng)后綜合癥等疾病中的重要作用日益受到人們的關(guān)注。近年來(lái)臨床上和實(shí)驗(yàn)室的大量研究表明染料木素具有一定的抗過(guò)敏作用，因此，本論文通過(guò)如

2、下3個(gè)動(dòng)物試驗(yàn)研究GEN在食物過(guò)敏性腹瀉中的抗過(guò)敏作用，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討:(1)在亞屏障環(huán)境下通過(guò)口服卵清蛋白構(gòu)建BALB/c小鼠的過(guò)敏性腹瀉模型，并對(duì)該模型中過(guò)敏反應(yīng)和腸道菌群的變化進(jìn)行分析;(2)分別在日糧中添加10 mg/kg和100 mg/kg的GEN，研究其對(duì)過(guò)敏性腹瀉模型中過(guò)敏癥狀、過(guò)敏反應(yīng)和腸道菌群的影響;(3)通過(guò)每天給BALB/c小鼠灌胃2 mg/kg BW和20 mg/kg BW的GEN，研究其對(duì)過(guò)敏性腹

3、瀉模型中腸粘膜屏障的影響。
　　 1.亞屏障環(huán)境下構(gòu)建食物過(guò)敏性腹瀉模型
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在亞屏障環(huán)境下構(gòu)建BALB/c小鼠的食物過(guò)敏性腹瀉模型。首先用卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）對(duì)雄性BALB/c小鼠進(jìn)行致敏，然后灌胃OVA誘導(dǎo)急性腹瀉，建立BALB/c小鼠過(guò)敏性腹瀉模型。ELISA檢測(cè)血清OVA-特異性IgG1和總IgE水平，氯乙酸酯酶染色法計(jì)數(shù)空腸肥大細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理組小鼠經(jīng)反復(fù)灌胃后出現(xiàn)腹瀉，而對(duì)照組

4、小鼠始終沒(méi)有出現(xiàn)腹瀉;與對(duì)照組小鼠相比，處理組小鼠血清OVA-特異性IgG1和總IgE水平均顯著升高，空腸肥大細(xì)胞數(shù)量顯著增加。這些結(jié)果表明，可以在亞屏障環(huán)境下通過(guò)口服OVA成功誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生過(guò)敏性腹瀉，建立食物過(guò)敏性腹瀉模型。
　　 2.食物過(guò)敏性腹瀉模型中腸道菌群的變化
　　 本研究旨在比較亞屏障環(huán)境下過(guò)敏性腹瀉模型中腸道菌群的變化。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用基于16S rRNA基因的PCR-DGGE技術(shù)和Real-tim

5、e PCR技術(shù)分析結(jié)腸細(xì)菌菌群的變化。PCR-DGGE分析表明，致敏組和假致敏組小鼠結(jié)腸細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)存在差異。Real-timePCR定量分析結(jié)果顯示，OVA致敏組小鼠結(jié)腸乳酸桿菌數(shù)量顯著減少，而雙歧桿菌和總細(xì)菌數(shù)量變化不顯著。提示食物過(guò)敏性腹瀉小鼠結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)失衡，特別是乳酸桿菌數(shù)量減少。
　　 3.GEN對(duì)食物過(guò)敏性腹瀉的影響
　　 本研究旨在探討OVA誘導(dǎo)的BALB/c小鼠過(guò)敏性腹瀉模型中GEN的抗過(guò)敏作用。64只

6、6～8周齡BALB/c，雌雄各半，隨機(jī)分為8組(n=8)，分別為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量GEN素組(2 mg/kg BW/d)和高劑量GEN組（20 mg/kg BW/d），GEN通過(guò)添加到日糧中的方式給藥。每次灌胃后觀察并記錄小鼠的腹瀉狀況，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄小鼠的體重和日采食量，用于GEN攝入量的校正。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低GEN處理緩解雌鼠腹瀉，高GEN處理加劇雌鼠腹瀉;低GEN和高GEN處理均加劇雄鼠過(guò)敏性腹瀉。這些結(jié)果表明，GEN對(duì)小

7、鼠過(guò)敏性腹瀉的作用具有劑量效應(yīng)和性別效應(yīng)。經(jīng)校正后低劑量組雌鼠和雄鼠GEN實(shí)際攝入量分別為1.22 mg/kg BW和1.42 mg/kgBW，高劑量組分別為12.2 mg/kg BW和14.2 mg/kg BW。
　　 4.GEN對(duì)食物過(guò)敏性腹瀉模型中過(guò)敏反應(yīng)的影響
　　 之前的研究結(jié)果表明合適劑量的GEN處理對(duì)雌鼠過(guò)敏性腹瀉具有一定的緩解作用，本研究從免疫學(xué)角度探討GEN在過(guò)敏性腹瀉模型中的抗過(guò)敏機(jī)制。比色法測(cè)定空腸

8、和結(jié)腸組織中髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性，Real-time PCR法測(cè)定空腸細(xì)胞因子的表達(dá)水平，ELISA法檢測(cè)血清OVA-特異性IgG1和總IgE水平，氯乙酸酯酶染色法計(jì)數(shù)空腸肥大細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠空腸和結(jié)腸MPO活性顯著增加;空腸IL-13表達(dá)顯著增加，而IFN-γ和IL10表達(dá)顯著減少;血清OVA-IgG1和總IgE均顯著增加;空腸和結(jié)腸肥大細(xì)胞數(shù)量均顯著增加。與陽(yáng)性對(duì)

9、照組相比，低劑量GEN處理可以顯著降低空腸MPO活力;顯著降低空腸IL-13表達(dá)，并提高IFN-γ表達(dá);顯著降低空腸肥大細(xì)胞數(shù)量。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，高劑量GEN處理可以顯著增加空腸肥大細(xì)胞數(shù)量。這些結(jié)果表明GEN通過(guò)改善腸道Th1/Th2平衡、抑制腸粘膜肥大細(xì)胞增生發(fā)揮其抗過(guò)敏作用。
　　 5.GEN對(duì)食物過(guò)敏性腹瀉模型中腸道菌群的影響
　　 腸道菌群與宿主相互作用在預(yù)防過(guò)敏性疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用，本實(shí)驗(yàn)主要研究OVA

10、誘導(dǎo)過(guò)敏性腹瀉后小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，以及GEN處理對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用基于16S rRNA基因的PCR-DGGE技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)分別對(duì)小鼠糞樣，結(jié)腸內(nèi)容物，以及空腸、回腸和結(jié)腸粘膜中腸道菌群的結(jié)構(gòu)和數(shù)量進(jìn)行分析。DGGE分析結(jié)果表明:小鼠糞樣菌群結(jié)構(gòu)在各實(shí)驗(yàn)組間無(wú)明顯變化;小鼠結(jié)腸內(nèi)容物和結(jié)腸粘膜菌群結(jié)構(gòu)在各實(shí)驗(yàn)組間出現(xiàn)條帶差異，在P組和H組中出現(xiàn)的一些條帶經(jīng)鑒定為Helicobacter typhl

11、onicus，Desulfovibrio sp.ABHU2SB和Shigellaflexneri的最相似菌。相似性分析結(jié)果也發(fā)現(xiàn)不同組別樣品分布在不同的簇。定量分析結(jié)果表明:結(jié)腸粘膜和內(nèi)容物中大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、梭菌Ⅳ群、擬桿菌和總細(xì)菌均存在顯著地分布差異，雙歧桿菌、擬桿菌和總細(xì)菌存在顯著的組別差異;空腸、回腸和結(jié)腸粘膜中乳酸桿菌、雙歧桿菌和梭菌Ⅳ群存在顯著地分布差異，乳酸桿菌存在顯著的組別差異。這些結(jié)果表明，OVA誘導(dǎo)過(guò)敏性

12、腹瀉后，小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，特別是出現(xiàn)了一些與腸道炎癥相關(guān)的病原菌，合適劑量的GEN處理可以抑制這些病原菌的定植，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。
　　 6.GEN對(duì)食物過(guò)敏性腹瀉模型中腸粘膜屏障的影響
　　 大量研究表明食物過(guò)敏患者中存在明顯的腸道屏障功能損傷，本實(shí)驗(yàn)主要研究OVA誘導(dǎo)過(guò)敏性腹瀉后小鼠腸道屏障結(jié)構(gòu)的變化，以及GEN處理對(duì)腸道屏障結(jié)構(gòu)的影響。32只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組(n=8)，分別為生理鹽水假致敏的

13、陰性對(duì)照組和OVA致敏的陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量染料木素(2mg/kg BW)組和高劑量染料木素(20mg/kg BW)組，染料木素通過(guò)灌胃的方式給藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，記錄所有小鼠的腹瀉狀況;HE染色觀察小鼠空腸組織形態(tài)的變化;透射電鏡觀察小鼠空腸粘膜上皮細(xì)胞間連接的變化;Real-time PCR和Western blot分別用于空腸粘膜緊密連接蛋白Occludin，Claudin-1和ZO-1的mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)分析;并對(duì)空腸肥大細(xì)

14、胞數(shù)量和緊密連接蛋白表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。HE染色結(jié)果表明相比于陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠絨毛變短、隱窩加深，絨毛高度和隱窩深度的比值顯著降低;電鏡結(jié)果表明陽(yáng)性對(duì)照組小鼠空腸粘膜上皮細(xì)胞間連接嚴(yán)重受損;Real-timePCR和Westernblot結(jié)果表明陽(yáng)性對(duì)照組小鼠空腸粘膜緊密連接蛋白Occludin，Claudin-1和ZO-1的表達(dá)均顯著降低。相比于陽(yáng)性對(duì)照組，低劑量染料木素處理緩解OVA誘導(dǎo)的過(guò)敏性腹瀉，顯著提高絨毛高度和隱窩

15、深度的比值，改善空腸粘膜上皮細(xì)胞間連接，顯著提高Claudin-1的mRNA表達(dá)水平和明顯增加Occludin和ZO-1的蛋白表達(dá)量;而高劑量染料木素則加重小鼠的過(guò)敏反應(yīng)，進(jìn)一步降低Occludin的蛋白表達(dá)量。相關(guān)性分析結(jié)果表明，空腸粘膜肥大細(xì)胞的數(shù)量與空腸粘膜Occludin的mRNA表達(dá)水平呈顯著地線性負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明，OVA誘導(dǎo)過(guò)敏性腹瀉后，小鼠腸道屏障結(jié)構(gòu)受損，合適劑量的GEN處理對(duì)腸粘膜屏障結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用，且腸道屏障結(jié)