巴斯德桿菌透明質酸合酶底物適應性分析及HA寡糖和TFA衍生物一鍋多酶法的合成.pdf

1、糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）是一類帶有負電荷的長鏈大分子多糖，它由重復的二糖單元結構組成，其中的雙糖單位是N-位乙?；蛄蛩峄募禾前放c一個糖醛酸以共價鍵連接起來的結構。根據雙糖單位的不同，糖胺聚糖包括透明質酸(hyaluronic Acid，HA)，硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)等。其中，HA的重復二糖單元是β1,4連接的葡

2、糖醛酸(glucuronic acid，GlcUA)和β1,3連接的N-位乙?；钠咸前罚∟-acetylglucosamine，GlcNAc）。HA以蛋白聚糖的形式廣泛存在于動物組織的細胞外基質中，其在細胞的發(fā)育、修復過程中發(fā)揮著重要作用，還是一些角膜、軟骨、肌腱、皮膚、結締組織等機體系統的重要組成成分。由于HA分子良好的親水性和黏彈性，其在醫(yī)學中應用于關節(jié)炎、眼科疾病及其他一些疾病的治療，另外也廣泛應用于化妝品及保健品中。
　

3、　來源于革蘭氏陰性A型巴斯德桿菌（Pasteurella multocida Type A）的HA聚合酶(pmHAS)屬于二型(ClassⅡ)聚合酶，含有972個氨基酸殘基，具有相對獨立的兩個糖基轉移酶活性區(qū)域。pmHAS1-703是可溶性的蛋白，分別以GlcNAc和GlcUA核苷酸活化的單糖作為供體，依次催化兩種單糖連接合成到糖鏈受體的非還原端，不斷地延長糖鏈。
　　pmHAS以及幾種糖核苷酸合成酶的一鍋多酶體系可以利用相對便宜

4、的底物來合成HA寡糖以及其TFA修飾的HA衍生物，節(jié)約了成本，簡化了反應過程以及純化步驟。其中TFA修飾的HA衍生物用來進行硫酸化HA生成的研究，進而用來驗證HA硫酸化衍生物是否具有抑制人源HA酶的活性而有效延長注射HA在體內的作用時間。
　　本論文研究內容和結果如下:
　　(1)構建了Pasteurella multocida Type A的HA聚合酶(pmHAS)的重組表達系統;確定了pmHAS誘導表達及純化的條件。

5、r>　　(2)初步分析了重組pmHAS的單糖供體及受體的底物適應性:除HA骨架外，與HA具有相同糖苷鍵連接形式的CS寡糖也可以作為pmHAS的合成受體;而HS骨架寡糖由于其糖苷鍵連接形式與HA差異較大，不能作為該酶的底物。
　　(3)構建了Arabidopsis thaliana的葡萄醛酸激酶(AtGlcAK)重組表達系統，確定AtGlcAK的表達純化條件，與UDP-sugar焦磷酸化酶(USP)合用體外酶法合成糖供體UDP-Gl