透明質(zhì)酸寡糖的制備及其活性研究.pdf

1、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖重復(fù)單位通過(guò)β-(1→4)糖苷鍵和β-(1→3)糖苷鍵構(gòu)成的無(wú)分支高分子糖胺聚糖，廣泛存在于動(dòng)物的組織細(xì)胞間質(zhì)和某些細(xì)菌的夾膜中。其相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)-般為1×10<'5>～1×10<'7>D，分子中兩種單糖的摩爾比為1：1。HA常用的制備方法有動(dòng)物組織提取法和細(xì)菌發(fā)酵法。 人們對(duì)HA的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和生理功能都進(jìn)行了較為充分的研究，其在臨床上的

2、應(yīng)用也日益廣泛。目前所用的HA的平均Mr一般都大于1×10<'5>D，HA寡糖(oligosaccharides ofhyaluronan，o-HA)是．Mr 1×104 D以下、單糖殘基數(shù)量為2～40的HA分子片段。o-HA屬于小分子多糖，其性質(zhì)與普通HA有很大不同，甚至具有完全相反的作用。本課題重點(diǎn)研究了o-HA的制備方法、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)分析及其促血管生成活性和抑制腫瘤的多藥耐藥作用。 1 o-HA的制備方法和分離方法研究研

3、究了用透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase，HAase)酶解制備o-HA的方法，對(duì)方法中主要的影響因素采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了優(yōu)化。HAase催化HA水解受溫度、pH值、酶濃度、底物濃度、反應(yīng)時(shí)間等因素的影響。HAase催化HA水解的最適反應(yīng)條件是底物濃度為10 g/L，酶濃度為1.5×10<'5>U/L，pH 5.0，反應(yīng)溫度為50℃。 o-HA的純度對(duì)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和結(jié)構(gòu)的確定十分重要，所以采用Bio-gel P6進(jìn)行分離，并通

4、過(guò)對(duì)各樣品的紫外(UV)光譜、紅外(IR)光譜、質(zhì)譜(MS)等的結(jié)果分析確定通過(guò)該分離方法制得的樣品為o-HA4、o-HA6、o-HA8、o-HA10四種寡糖。 2 o-HA的促血管生成活性研究探討了o-HAs對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖的影響及其促血管生成作用。采用噻唑藍(lán)(MTT)法觀察o-HAs對(duì)于HUVEC的增殖作用；并研究了o-HA在雞胚絨毛尿囊膜模型(CAM)中的促血管生成作用。證明了。-HA6、o-HA8

5、、o-HA10有促血管生成作用，o-HA4沒(méi)有此作用。o-HA6、o-HA8、o-HA10在18.75～150μg/mL的濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)HUVEC增殖，并且這3種寡糖表現(xiàn)出較為一致的影響作用。 3 o-HA的抑制腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性研究本研究對(duì)o-HAs的體外逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥細(xì)胞(K562/A02)的耐藥性并其逆轉(zhuǎn)機(jī)制進(jìn)行探討。以MTT法檢測(cè)o-HAs對(duì)K562/A02細(xì)胞的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)活性；以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。o-HAs對(duì)K562

6、/A02細(xì)胞內(nèi)抗癌藥物阿霉素(ADR)累積的影響。o-HAs在體外具有較強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞多藥耐藥的活性，在100 μg/mL濃度時(shí)o-HA4、o-HA6、o-HA8、o-HA10使ADR對(duì)K562/A02的半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)由61.6μg/mL分別降低至30.17、30.04、32.29、33.33μg/mL。細(xì)胞中ADR的累積量增加至原來(lái)的3.90、3.92、3.76、3.39倍。 本課題的主要成果：

7、 (1)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定HAase催化HA水解的最適反應(yīng)條件：底物濃度為10 g/L，酶濃度為1.5×10<'5>U/L，pH 5.0，反應(yīng)溫度為50℃。確定分離的色譜條件，制得o-HA4、o-HA6、o-HA8、o-HA10四種寡糖。 (2)研究o-HA的促血管生成作用，首次將o-HA4、o-HA6、o-HA8、o0HA10進(jìn)行比較研究，證明了o-HA4沒(méi)有促血管生成作用，o-HA6、o-HA8、o-HA10有此作用，且三者