人參皂苷Rd的生物合成制備及其生物活性研究.pdf

1、腦卒中是造成人們死亡的主要病種之一。長期以來由于缺少有效的治療藥物和治療方法,尋找和研究有效的腦卒中病防治藥物和方法一直是全世界醫(yī)藥研究者迫切的科研任務。近年來鈣離子內流促進腦細胞死亡的理論引起了尋找新的鈣通道拮抗劑來治療急性腦卒中藥物研究熱潮,尋找受體依賴性鈣通道阻斷劑成為用于急性缺血性腦卒中治療藥物研究的主要方向。
　　 人參皂苷-Rd作為一種新型鈣離子拮抗藥物,與傳統(tǒng)鈣拮抗藥物作用靶點不同,具有特異性阻斷受體依賴性鈣離子通

2、道的功能,有望取得比傳統(tǒng)藥物治療更好的療效。目前人參皂苷Rd正作為治療腦中風新藥研發(fā),已進入了Ⅲ期臨床研究階段。
　　 人參皂苷Rd在人參中含量較低,因其結構復雜,化學合成至今尚未成功,目前主要依靠從人參、三七等植物根、莖、葉中提取來獲得人參皂苷Rd,由于提取方法收率低,成本較高,影響了人參皂苷Rd的進一步研究和臨床應用,因此有必要開發(fā)一種產率高,純度好,并且簡單易行的制取人參皂苷Rd的新方法。
　　 人參皂苷Rb1在三

3、七中含量達到2％,為主要皂苷,人參皂苷Rb1與Rd的差別在于C-20位糖鏈末端的糖苷鍵,理論上可以通過水解人參皂苷Rb1 C-20位外側糖基得到人參皂苷Rd。但因其化學轉化困難,所以生物合成方法成為研究的熱點。生物合成是制備人參皂苷Rd有效的方法,但是也遇到了些問題,比如對轉化底物純度要求高,高濃度底物對菌體轉化抑制,投料量低,轉化專一性差,使得轉化得到人參皂苷Rd的效率相對較低,仍難以達到工業(yè)化生產的目的。鑒于制備人參皂苷Rd相關報道

4、利用的菌株都是野生型,最后又都遇到上面這些共同問題。因此,我們從微生物轉化途徑方面考慮,利用誘變方法對菌株改造,從而克服遇到的難題,實現(xiàn)人參皂苷Rd的產業(yè)化。
　　 本研究通過UV-Li1l聯(lián)合誘變對親代菌株Paecilomyces bainier sp.229進行改造,并且在高濃度三七莖葉皂苷培養(yǎng)基中培養(yǎng),篩選出耐受60mg/mL三七莖葉皂苷的菌株,進一步篩選得到可以將人參皂苷Rb1專一性轉化到人參皂苷Rd的菌株,編號為Pae

5、cilomyces bainier sp.229-7。
　　 經過培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件優(yōu)化,搖瓶試驗結果顯示,底物投料量為20mg/mL時最高轉化率可以達到94.92％。制備規(guī)模放大到10 L發(fā)酵罐水平,5L裝液量,投入100g底物時,轉化率達到87.9％,底物投料量是已有報道的1000倍,轉化率提高了7.9％。
　　 在得到大量發(fā)酵產物后,我們對產物進行了提取和分離純化,得到的了純度較高的單體,建立了實驗室規(guī)模純化制備