金櫻子總黃酮的制備及生物活性研究.pdf

1、目的:制備金櫻子總黃酮(TFs)并考察其生物活性。
　　 方法:本研究主要從以下方面進行:(1)TFs的制備及質(zhì)量。以總黃酮的含量為測定對象,利用正交試驗法優(yōu)選總黃酮的提取工藝條件:通過D101大孔樹脂工藝制備高純度的總黃酮(TFs);并通過HPLC指紋圖譜和對水解產(chǎn)物黃酮苷元的測定來建立質(zhì)量標準。(2)總黃酮體內(nèi)外抗氧化活性實驗。在體外考察其對DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、OH(羥基自由基)、O2(超氧陰離子)和

2、H2O2(過氧化氫)的清除作用以及還原力的測定,并考察了其對紅細胞溶血和脂質(zhì)過氧化的抑制作用,以維生素C(Vit C)作為陽性對照。此外,通過給藥后小鼠血清、肝和腎組織中T-AOC(總抗氧化能力),SOD(超氧化物岐化酶)和MDA(丙二醛)水平的變化來評估它的體內(nèi)抗氧化能力。(3)總黃酮對小鼠高脂血癥的保護作用及其機制研究。正常小鼠分別給予高脂飲食和不同給藥劑量總黃酮(25,50 mg/kg,I.g.),并以非諾貝特為陽性對照。實驗結(jié)束

3、后,通過測定血清的TC(總膽固醇)、TG(甘油三酯)和HDL-C(高密度脂蛋白)的水平評價其降脂活性。通過組織病理學(xué)、ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)、AST(谷草轉(zhuǎn)氨酶)和ALP(堿性磷酸酶)等指標的測定探討總黃酮對高脂飲食所致的脂肪肝的保護作用。此外還考察了其對實驗動物中體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的影響。(4)總黃酮對高脂血癥大鼠的治療作用及其血液流變學(xué)影響。造模后的高脂大鼠給予總黃酮(100 mg/kg)和陽性對照藥非諾貝特4周。實驗結(jié)束后測定血清的TC

4、、TG和HDL-C水平評價其降脂活性。并通過測定血液流變學(xué)的變化來驗證其降脂活性。(5)總黃酮對撲熱息痛誘導(dǎo)的急性小鼠肝損傷的保護作用及其機制研究。在這項研究中,小鼠分別被灌胃不同劑量的總黃酮(50和200 mg/kg)和聯(lián)苯雙酯(100 mg/kg)5天,在最后一次給藥2 h后,除空白組所有實驗動物腹腔注射撲熱息痛(400 mg/kg)。實驗結(jié)束后,測定血清的ALT、AST、MDA、SOD和GSH(谷胱甘肽)等指標來考察TFs對肝損傷

5、的保護作用和體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的影響。并通過Western blotting、免疫組化和RT-PCR等技術(shù)來考察相關(guān)蛋白和mRNA的表達水平。(6)通過急性毒性試驗來初步考察金櫻子總黃酮的毒性。
　　 結(jié)果:正交試驗法優(yōu)化的金櫻子最佳提取條件是用8倍量的60％乙醇回流提取2 h,共2次;D101樹脂制備工藝是用4倍樹脂柱床體積的水除雜和6倍樹脂柱床體積的40%乙醇洗脫得到純度為78.45%的TFs。產(chǎn)物經(jīng)水解后經(jīng)HPLC分析顯示槲皮

6、素、山柰素、異鼠李素的總含量為7.37%。體內(nèi)外抗氧化活性實驗顯示TFs對DPPH、OH和O2有較強的清除作用,其IC50值分別為0.01、0.04和0.08 mg/mL,還原力稍弱于陽性對照Vit C。TFs在濃度為0.35 mg/mL和2.00 mg/mL時,還分別具有71.62%和48.45%的紅細胞溶血和脂質(zhì)過氧化的抑制作用。在體內(nèi)抗氧化方面,TFs(100 mg/kg)能明顯提高血清和肝和腎組織中T-AOC和SOD的水平,并顯

7、著降低MDA;TFs在50 mg/kg的給藥劑量時,高脂血癥小鼠血清TC、TG和IJDL-C水平分別下降了45.02%、33.86%和73.68%,而HDL-C則顯著高于模型組,與陽性藥相比(分別降低39.22%、36.06%和76.08%)藥效相當(dāng)。組織病理學(xué)、ALT、AST和ALP等指標均顯示TFs對肝臟具有良好的保護作用,其中,ALT、AST和ALP分別升高了55.85%、29.15%和25.68%。此外,TFs能顯著降低MDA水

8、平,提高CAT(過氧化氫酶)、SOD、GSH、GPX(谷胱甘肽過氧化酶)水平;TFs對高脂大鼠的治療作用及其血液流變學(xué)研究顯示金櫻子總黃酮在給藥100 mg/kg時對高脂大鼠的血清TC和TG分別極顯著地降低了60.80%和62.39%(p＜0.01),略強于非諾貝特(40 mg/kg,分別降低56.82%和56.99%)。TFs能降低全血比粘度(低切、高切)49.59%和63.24%(p＜0.01),血漿比粘度、血清比粘度和RBC聚集指

9、數(shù)均明顯降低(p＜0.05),而纖維蛋白含量無明顯變化。與模型組相比,在對撲熱息痛誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護作用中,高劑量給藥組小鼠血清的ALT、AST和MDA分別下降由78.42%、70.85%和30.52%,而SOD和GSH顯著高于模型組(p＜0.05),強于陽性藥的效果。TFs能顯著提高Procaspase-3、ProcasDase-8、FasL、Prohibitin和Bcl-2的蛋白表達水平,明顯降低中Fas、Bax、p53和N

10、F-κB p65的蛋白表達,同時下調(diào)TNF-α的表達。在急性毒性實驗中,我們發(fā)現(xiàn)金櫻子總黃酮在給藥劑量為20 g/kg時未見任何動物死亡。
　　 結(jié)論:本實驗中從中藥金櫻子中制備得到的總黃酮,具有制備工藝簡單、含量高、質(zhì)量可控等優(yōu)點,適合于工業(yè)化生產(chǎn)。進一步的藥效活性顯示制備得到的總黃酮具有顯著的體內(nèi)外抗氧化活性、對高脂血癥及心腦血管疾病有著很好的預(yù)防和保護作用,同時也對藥物性肝損傷有著很好的保護作用。以上結(jié)果表明金櫻子總黃酮在