兩種多溴聯(lián)苯醚對褶皺臂尾輪蟲生殖與發(fā)育毒性效應(yīng)及其作用機制的初步研究.pdf

1、多溴聯(lián)苯醚（polybrominated diphenyl ethers, PBDEs）是一類在海洋環(huán)境中廣泛存在的持久性有機污染物（persistent organic pollutants, POPs），對海洋環(huán)境和海洋生物的影響日趨嚴重。褶皺臂尾輪蟲（Branchionus plicatilis）是一類重要的無脊椎海洋浮游動物，在海洋生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動中起著重要作用，并且是有機污染物進入海洋食物鏈的重要途徑。但目前有關(guān)PB

2、DEs對褶皺臂尾輪蟲的研究還非常有限。因此，本研究選擇在海洋環(huán)境和海洋生物體內(nèi)廣泛存在的BDE-47（tetrabrominated diphenyl ether-47, BDE-47）和BDE-209（decabrominated diphenyl ether-209, BDE-209）為脅迫因子，首次將具有重要海洋生態(tài)學意義的褶皺臂尾輪蟲為實驗對象，從個體、組織、細胞、分子等不同生物層次上系統(tǒng)研究PBDEs急性與慢性脅迫對褶皺臂尾輪

3、蟲的生殖及發(fā)育毒性效應(yīng)，并對可能的氧化應(yīng)激（oxidative stress）作用機制進行了初步的探討。
　　研究的主要方法與結(jié)果如下：
　　1.通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）方法對實驗體系中BDE-47和BDE-209實際濃度的檢測得出 BDE-47和 BDE-209的溶解濃度低于配制濃度，且BDE-209的溶解度遠遠小于BDE-47的溶解度。
　　2.通過Log-probit方法分析得出BDE-47對褶皺臂

4、尾輪蟲24h-EC50值為7.923 mg/L（95％confidence intervals,3.626~13.634 mg/L）；同樣濃度下，BDE-209對褶皺臂尾輪蟲沒有發(fā)現(xiàn)半數(shù)抑制效應(yīng)。
　　3.0.2 mg/L的BDE-47和BDE-209分別對褶皺臂尾輪蟲脅迫24小時后，利用倒置顯微鏡觀察到，兩種同系物均會導(dǎo)致褶皺臂尾輪蟲卵巢組織形態(tài)萎縮、脂質(zhì)小滴數(shù)量減少，且BDE-47對卵巢產(chǎn)生的影響更為明顯。
　　4.以第

5、一次產(chǎn)幼時間、最后一次產(chǎn)幼時間、產(chǎn)卵數(shù)、產(chǎn)幼數(shù)和產(chǎn)幼率等生理學指標作為褶皺臂尾輪蟲生殖毒性檢測指標在解剖鏡下進行觀測分析。與對照組相比，BDE-47和BDE-209各濃度組均能顯著提前（P<0.05或 P<0.001）褶皺臂尾輪蟲的第一次產(chǎn)幼時間；BDE-47和BDE-209（0.1 mg/L,0.2 mg/L）可顯著（P<0.05或 P<0.001）提前褶皺臂尾輪蟲的最后一次產(chǎn)幼時間；此外，各濃度的BDE-47能極顯著（P<0.001

6、）降低褶皺臂尾輪蟲的產(chǎn)卵數(shù)與產(chǎn)幼數(shù)；0.1 mg/L,0.2 mg/L的BDE-47能極顯著（P<0.001）降低褶皺臂尾輪蟲的孵化率；但各濃度的BDE-209不但對這三項指標沒有產(chǎn)生抑制效果，反而有微弱的促進作用。
　　5.選擇生殖前期、生殖期和生殖后期作為褶皺臂尾輪蟲發(fā)育毒性生理學檢測指標在解剖鏡下進行觀測分析。與對照組相比，BDE-47和BDE-209各濃度組均能顯著縮短（P<0.01或 P<0.001）褶皺臂尾輪蟲的生殖前

7、期；BDE-47（0.2 mg/L）和BDE-209（0.1 mg/L,0.2 mg/L）可極顯著（P<0.001）縮短褶皺臂尾輪蟲生殖期；BDE-47（0.1 mg/L,0.2 mg/L）和BDE-209（0.2 mg/L）可顯著（P<0.01或 P<0.001）縮短褶皺臂尾輪蟲的生殖后期。
　　6.通過篩選生殖與發(fā)育相關(guān)生理學指標進行因子分析（Factor Analysis, FA）得出：生殖期和最后一次產(chǎn)幼時間兩項指標較于其

8、他檢測指標對 BDE-47和BDE-209最為敏感；BDE-47與BDE-209獨立分析結(jié)果顯示，BDE-47對褶皺臂尾輪蟲的毒性效應(yīng)側(cè)重于對成體階段的生殖毒性，而 BDE-209對褶皺臂尾輪蟲的毒性效應(yīng)則傾向于對幼體階段的發(fā)育毒性。
　　7.活性氧（Reactive oxygen species, ROS）和鈣離子（Calcium ion, Ca2+）分別負載熒光探針DCFH-DA和Fluo-3/AM后，先通過熒光顯微鏡觀察它們

9、在褶皺臂尾輪蟲體內(nèi)的熒光強度及分布情況，然后使用 Image-Pro Plus軟件選定卵巢部位對其熒光值進行分析計算。與對照組相比，BDE-47（0.1 mg/L,0.2 mg/L）和 BDE-209（0.2 mg/L）能顯著升高（P<0.01或 P<0.001）卵巢細胞內(nèi)ROS的水平以及Ca2+濃度（[Ca2+]）。
　　8.通過實時定量PCR（Real-Time quantitative PCR，qRT-PCR）檢測與生殖發(fā)育

10、相關(guān)的vasa和 nanos的基因表達，以及與氧化應(yīng)激系統(tǒng)相關(guān)的sod、cat和cam的基因表達。與對照組相比，結(jié)果表明，BDE-47（0.2 mg/L）能顯著（P<0.01）激活sod的基因表達；BDE-47和 BDE-209（0.2 mg/L）能顯著（P<0.01）激活cam的基因表達；但BDE-47和BDE-209對cat基因的表達水平均沒有產(chǎn)生顯著影響。
　　得出的主要結(jié)論如下：
　　1. GC-MS實驗表明，BDE

11、-47和BDE-209均難溶于水，且BDE-209的溶解度小于BDE-47的溶解度；
　　2.急性毒性實驗表明，BDE-47對褶皺臂尾輪蟲的急性毒性大于BDE-209；
　　3.基于形態(tài)學觀察、生理學指標檢測以及分子水平上對 vasa和 nanos基因表達的研究，表明褶皺臂尾輪蟲對 BDE-47和 BDE-209脅迫非常敏感，且推斷卵巢組織是 BDE-47和 BDE-209脅迫褶皺臂尾輪蟲的作用靶器官。
　　4.生殖與

12、發(fā)育毒性效應(yīng)實驗表明，不論是具有較高毒性的低溴代聯(lián)苯醚BDE-47還是具有較低毒性的高溴代聯(lián)苯醚 BDE-209都會抑制褶皺臂尾輪蟲的生殖與發(fā)育，在個體水平以及分子水平均會產(chǎn)生生殖與發(fā)育毒性效應(yīng)，且 BDE-47較于BDE-209具有更強的生殖毒性與發(fā)育毒性；此外，低濃度的BDE-209還可能具有潛在的外源性雌激素（xenoestrogen）的作用。
　　5. FA研究表明，在生殖與發(fā)育毒性的各項生理學指標中，生殖期和最后一次產(chǎn)幼

13、時間對兩種PBDEs的同系物均最為敏感，因此可作為生物標志物的候選指標。
　　6.氧化應(yīng)激作用機制的研究表明，BDE-47和 BDE-209能引起褶皺臂尾輪蟲卵巢組織細胞內(nèi) ROS水平的升高，當 ROS水平達到產(chǎn)生氧化脅迫的水平時，便會激活抗氧化系統(tǒng)（antioxidant system）中抗氧化酶 sod和 cat的表達以及影響 Ca2+平衡和 cam的表達水平，以期通過基于Ca2+信號通路的氧化應(yīng)激作用機制的調(diào)控以消除或減弱