兩種多溴聯(lián)苯醚(BDE-47和BDE-209)誘導(dǎo)Neuro-2a的細(xì)胞毒性與細(xì)胞凋亡及分子調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、多溴聯(lián)苯醚（Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）作為溴代阻燃劑廣泛應(yīng)用于各種消費(fèi)類(lèi)產(chǎn)品，已成為全球范圍內(nèi)的持久性環(huán)境污染物。PBDEs釋放到環(huán)境介質(zhì)中持久存在并且難降解，造成環(huán)境污染并通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，危害人體健康，日益引起國(guó)際社會(huì)的關(guān)注。PBDEs不僅能影響生物體的生長(zhǎng)、神經(jīng)發(fā)育和生殖，還可以在細(xì)胞和分子水平導(dǎo)致氧化應(yīng)激、促使自由基的產(chǎn)生，影響相關(guān)基因的表達(dá)，甚至引起細(xì)胞死亡。本研究通過(guò)體外細(xì)胞

2、實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究BDE-47(tetrabrominated diphenylether-47,BDE-47)和BDE-209(decabrominated diphenylether-209，BDE-209)對(duì)小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuro-2a)的神經(jīng)毒性作用及其產(chǎn)生機(jī)制。擬采用外源性干擾細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和鈣離子(Ca2+)水平，闡明細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca2+水平變化與PBDEs誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)

3、胞凋亡的關(guān)系。檢測(cè)p38 MAPK和核因子NF-E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid2-related factor2，Nrf2)通路相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，闡明BDE-47和BDE-209誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞凋亡過(guò)程中ROS和Ca2+介導(dǎo)的信號(hào)通路。對(duì)BDE-47和BDE-209的毒性和機(jī)制的研究，為PBDEs所致神經(jīng)毒性的分子機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)，也為預(yù)防控制PBDEs對(duì)機(jī)體健康的危害提供基礎(chǔ)資料和理論

4、依據(jù)。
　　研究結(jié)果如下:
　　1、BDE-47和BDE-209對(duì)Neuro-2a細(xì)胞的毒性效應(yīng)
　　(1)MTT和臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BDE-47和BDE-209具有明顯的細(xì)胞毒性作用，均能顯著降低Neuro-2a細(xì)胞的活力，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，增加細(xì)胞死亡率。LDH釋放實(shí)驗(yàn)顯示BDE-47和BDE-209能造成細(xì)胞膜損傷，促使細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶的釋放。并且BDE-47比BDE-209呈現(xiàn)出更高的損傷能力和抑制效果。流式細(xì)胞術(shù)

5、檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示BDE-47對(duì)Neuro-2a細(xì)胞具有顯著的周期阻滯作用，將細(xì)胞阻滯于G1期。光學(xué)倒置顯微鏡，Hoechst33342染色觀察Neuro-2a細(xì)胞形態(tài)，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染的流式檢測(cè)結(jié)果表明BDE-47和BDE-209能夠不同程度的誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞凋亡，且BDE-47比BDE-209誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的程度大。以上結(jié)果表明BDE-47和BDE-209均能產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性作用，且BDE-47對(duì)Neuro-2

6、a細(xì)胞表現(xiàn)出更大的細(xì)胞毒性。
　　(2)BDE-47能夠干擾Neuro-2a細(xì)胞正常周期進(jìn)程，將細(xì)胞阻滯于G1期;Western Blot和qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示BDE-47可以增加Neuro-2a細(xì)胞內(nèi)p53和p21mRNA的表達(dá)水平，通過(guò)抑制周期相關(guān)蛋白（cyclin D1和CDK2）的表達(dá)，降低磷酸化Rb蛋白水平，從而調(diào)控Neuro-2a細(xì)胞G1/S時(shí)相的轉(zhuǎn)換，將細(xì)胞停滯于G1期而不能進(jìn)入S期，最后導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。

7、BDE-209對(duì)Neuro-2a細(xì)胞周期則沒(méi)有明顯的影響。
　　2、BDE-47和BDE-209通過(guò)死亡受體通路、線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路3條凋亡通路誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞凋亡
　　(1)qRT-PCR和Caspase活性檢測(cè)結(jié)果顯示BDE-47和BDE-209增加受體蛋白Fas mRNA和Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白FADD mRNA的表達(dá)水平，同時(shí)增加Caspase-8蛋白活性，最后增加Caspase-3蛋白活性，通過(guò)死亡受

8、體通路誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞凋亡;
　　(2)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示BDE-47和BDE-209能增加促凋亡蛋白Bax的mRNA表達(dá)水平，增高Bax/Bcl-2比值;流式細(xì)胞術(shù)，Western Blot和Caspase活性檢測(cè)結(jié)果顯示BDE-47和BDE-209降低Neuro-2a細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)，增加胞質(zhì)中細(xì)胞色素C(cytochromeC，Cyt

9、C)蛋白表達(dá)水平，增加Caspase-9的活性，最后激活Caspase-3，能通過(guò)線粒體通路誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞凋亡;
　　(3)qRT-PCR和Caspase活性檢測(cè)結(jié)果顯示BDE-47和BDE-209能增加GRP78和CHOP mRNA的表達(dá)，并且增加Caspase-12活性通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞凋亡。
　　3、細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca2+介導(dǎo)的信號(hào)通路參與 BDE-47和BDE-209誘導(dǎo)Neuro-2a

10、細(xì)胞凋亡的過(guò)程
　　(1)應(yīng)用特異性熒光染料二乙酸-2'，7'-二氯熒光素鹽(2'，7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA)檢測(cè)BDE-47和BDE-209脅迫的Neuro-2a細(xì)胞內(nèi)總ROS水平的變化，結(jié)果表明BDE-47和BDE-209呈劑量依賴(lài)性的增加細(xì)胞內(nèi)總ROS水平。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cyste ine，NAC)能夠抑制BDE

11、-47和BDE-209所致的細(xì)胞內(nèi)總ROS水平的升高，緩解BDE-47和BDE-209所致細(xì)胞凋亡的程度和細(xì)胞MMP下降的程度，BDE-47和BDE-209可能通過(guò)活性氧介導(dǎo)線粒體通路誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞凋亡。
　　(2)BDE-47和BDE-209脅迫后，促使細(xì)胞內(nèi)總ROS水平升高，破壞Neuro-2a細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡。對(duì)丙二醛(malonaldehyde，MDA)檢測(cè)結(jié)果顯示BDE-47增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MD

12、A含量，造成細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。BDE-209沒(méi)有明顯的變化。對(duì)谷胱甘肽(glutathiose，GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)BDE-47和BDE-209能不同程度的升高GSSG/GSH的比率，使Neuro-2a細(xì)胞處于氧化應(yīng)激的狀態(tài)。同時(shí)，啟動(dòng)Neuro-2a細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示Nrt2基因表達(dá)上調(diào)，抗氧化反應(yīng)元件(antioxidantresponse element，ARE)下游的抗氧

13、化酶和解毒酶(HO-1、NQO1、GPX、GCLM和GCLC)表達(dá)水平都有不同程度的增加，GR基因表達(dá)水平下降，抗氧化/解毒酶響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，提示Nrf2-ARE通路參與了BDE-47和BDE-209內(nèi)源性應(yīng)激防御機(jī)制。
　　(3)應(yīng)用熒光染料Fluo-3 AM檢測(cè)BDE-47和BDE-209脅迫Neuro-2a細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的變化，BDE-47和BDE-209均能在前10 min內(nèi)呈劑量依賴(lài)性的增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+水

14、平。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示Ca2+螯合劑（BAPTA）能抑制BDE-47和BDE-209所致的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的升高，緩解BDE-47和BDE-209所致細(xì)胞凋亡的程度，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的升高是BDE-47和BDE-209誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞凋亡的另一原因。光溜海綿素(Xestospongin C，XeC)和丹曲林(Dantro1ene，Dan)是細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)的抑制劑，Xe C和Dan均能抑制BDE-47和BDE-209所致的N

15、euro-2a細(xì)胞內(nèi)升高的Ca2+水平，也能緩解BDE-47和BDE-209所致細(xì)胞凋亡的程度，Neuro-2a細(xì)胞凋亡過(guò)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使得Ca2+外流，導(dǎo)致BDE-47和BDE-209誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞凋亡過(guò)程中Ca2+水平升高。
　　(4)AlphaScreen技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK磷酸化水平結(jié)果顯示:BDE-47和BDE-209均能增加Neuro-2a細(xì)胞內(nèi)磷酸化p38 MAPK蛋白的表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

16、顯示p38 MAPK抑制劑SB203580可以顯著性的抑制BDE-47和BDE-209導(dǎo)致Neuro-2a細(xì)胞凋亡，提示p38 MAPK通路參與了BDE-47和BDE-209誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，使用抗氧化劑NAC和細(xì)胞內(nèi)Ca2+螯合劑BAPTA能降低BDE-47和BDE-209所致的Neuro-2a細(xì)胞內(nèi)磷酸化p38MAPK蛋白水平，提示BDE-47和BDE-209能通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的ROS和Ca2+通過(guò)介導(dǎo)p38 MAPK