一種利用線粒體DNA鑒別羊肉、雞肉、鴨肉、豬肉的PCR檢測(cè)方法.pdf

1、近年來(lái)隨著市場(chǎng)對(duì)羊肉的需求逐漸增加，羊肉的造假現(xiàn)象屢禁不止，不僅擾亂了經(jīng)濟(jì)秩序，而且危害人們身體健康。市場(chǎng)上尤以豬肉、雞肉、鴨肉冒充綿羊肉的現(xiàn)象為多。但是現(xiàn)階段我國(guó)對(duì)羊肉的制作加工沒(méi)有任何標(biāo)準(zhǔn)可循，因此，要想打擊假羊肉的制作銷(xiāo)售，首先要制定統(tǒng)一的檢測(cè)方法。
　　 本研究的目的是建立一種能夠一次性的快速區(qū)分出綿羊肉中摻入的豬、雞、鴨成分的多重PCR檢測(cè)方法。動(dòng)物的線粒體DNA具有分子量小、結(jié)構(gòu)保守、熱穩(wěn)定性好、不易降解的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和

2、母系遺傳、拷貝數(shù)多、進(jìn)化速度快、不發(fā)生重組的遺傳特點(diǎn)，對(duì)線粒體DNA的序列分析所提供的信息已廣泛應(yīng)用于研究物種之間和物種內(nèi)部的系統(tǒng)進(jìn)化分析、動(dòng)物源性成分鑒定等領(lǐng)域。
　　 應(yīng)用NCBI的在線BLAST程序、DNAMAN等軟件分析線粒體DNA的保守區(qū)域和多變區(qū)域，用Oligo6.0、Primer5.0等設(shè)計(jì)引物，對(duì)所設(shè)計(jì)的30余對(duì)引物逐一進(jìn)行試驗(yàn)，最終在線粒體DNA上確定了4對(duì)引物。每一對(duì)引物分別針對(duì)一種動(dòng)物，能夠檢出4個(gè)物種的各

3、自的特異性的線粒體DNA片段，4對(duì)引物擴(kuò)增出來(lái)的片段長(zhǎng)度有明顯的差異，能在電泳檢測(cè)中區(qū)分出來(lái)，同時(shí)這4對(duì)引物退火溫度大致相同、對(duì)反應(yīng)體系的要求差別不大（Mg2+濃度對(duì)該反應(yīng)影響不大），實(shí)現(xiàn)了一次多重PCR反應(yīng)能夠擴(kuò)增出4種目的條帶。通過(guò)全面的試驗(yàn)，排除了4對(duì)引物和4種物種之間發(fā)生相互干擾的可能性，保證了多重PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確性。最終確定了多重PCR方法的體系和條件。
　　 本研究建立的檢測(cè)方法的步驟是:(1)用組織基因組DNA提取

4、試劑盒提取待測(cè)樣品的基因組DNA。(2) PCR擴(kuò)增。(3)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，與DNA Marker或標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)照確定待測(cè)樣品成分。
　　 為了確認(rèn)該檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，必須估測(cè)其靈敏性、準(zhǔn)確性。將基因組DNA稀釋1000倍后，用該方法仍能檢測(cè)出待測(cè)肉樣。待測(cè)肉樣的基因組DNA與其他物種的DNA混合后，檢測(cè)的靈敏性不受影響。用玉米粉和魚(yú)肉模擬實(shí)際應(yīng)用時(shí)遇到的植物性或動(dòng)物性雜質(zhì)，在提取DNA時(shí)加入玉米粉或魚(yú)肉，靈敏性